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过表达miR-141对舌癌Tscca和Tca-8113细胞侵袭、迁移影响

2021-03-05 214 上传者：管理员

摘要：目的:研究过表达miRNA-141对舌癌细胞迁移和侵袭的影响。方法:使用miR-141慢病毒Ubi-miR-141-SV40-EGFP-IRES-puromycin(miR-141组)和慢病毒空载体Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin(miR-NC组)转染两组舌癌细胞系(Tscca、Tca-8113细胞系),未转染的细胞为空白组(Blank)。采用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-141基因表达,RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Westernblot)检测基质金属蛋白酶2、9(MMP2、9),E盒结合锌指蛋白2(zeb2)的mRNA和蛋白表达。结果:流式细胞术测定转染率,Tscca细胞中miR-141组转染率为82.4%、miR-NC组为87.3%;Tca-8113细胞中miR-141组转染率为73.4%、miR-NC组为89.1%。RT-qPCR结果显示:miR-141组中miR-141表达明显高于miR-NC组和Blank组,证明稳定转染的细胞株建立成功。Tscca和Tca-8113细胞中miR-141组和miR-NC组、Blank组组间比较,MMP2、MMP9、zeb2的mRNA和蛋白表达均降低。结论:在Tscca和Tca-8113细胞中通过过表达miR-141抑制细胞中MMP2、MMP9、zeb2的mRNA和蛋白表达来控制细胞迁移和侵袭能力。

关键词：
E盒结合锌指蛋白2
microRNA-141
上皮间质转化
基质金属蛋白
舌癌
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口腔鳞癌(OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一[1]。有报道指出遗传异常与口腔鳞癌的发生和发展之间有关联[2]。舌癌约占口腔恶性肿瘤的50%～60%,是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一。其恶性程度较高,侵袭性强,极易发生淋巴结转移[3],通常导致言语、咀嚼和吞咽功能障碍[4]。因此研究舌癌的分子机制寻找可用于改善临床诊断和治疗的生物标志物至关重要。

微小RNA(miRNA)为非编码RNA,通过结合靶信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(3'UTR)促进mRNA降解或抑制蛋白翻译来调节靶蛋白表达。已证明miRNA在不同的癌症中通过与各种肿瘤抑制剂和启动因子的相互作用发挥生物学功能[5]。miR-141属于miR-200家族,在肿瘤的预防和治疗中具有重要的潜在价值。有研究表明miR-141在各种癌症中表达下调,可能作为肿瘤抑制因子[6],据报道其在胃癌、肾透明细胞癌、头颈部鳞癌、乳腺癌和结直肠癌等肿瘤中显著降低[7,8,9,10,11];在宫颈癌和食管癌[12,13]等肿瘤中表达显著增加。在口腔鳞癌中miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-141)表达下调[14]。miR-141在舌癌中的研究较少,故本实验研究在舌癌细胞中miR-141对细胞的迁移和侵袭能力的影响。

1、材料和方法

1.1材料

人舌癌细胞株Tca-8113和Tscca细胞系;澳洲胎牛血清(美国Gibco公司);RPMI-1640培养基、双抗、胰蛋白酶(美国Hyclone公司);CCK-8试剂盒(博士德生物公司);Ubi-miR-141-SV40-EGFP-IRES-puromycin、Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin(吉凯基因生物公司);逆转录试剂盒(北京Thermo公司);荧光定量试剂盒(凯杰公司);逆转录试剂盒、RIPA裂解液(北京Thermo公司);Trizol总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司);SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);4×蛋白上样缓冲液、Transwell小室(Corning公司);蛋白印迹显色试剂盒(美国Invitrogen公司);凋亡试剂盒(美国BD公司);MMP9、zeb2兔单克隆抗体,MMP2鼠多克隆抗体购自于Abcam公司。

1.2仪器

超净工作台、LeicaDMI4000B/DM5000B(美国Leica公司)、低温离心机(美国Sigma公司);Westernblot电泳装置及转膜装置(美国Bio-Red公司)。

1.3细胞培养

配制含10%血清和0.5%双抗的RPMI-1640完全培养基培养细胞。在37℃、含5%二氧化碳条件下湿润培养Tca-8113和Tscca细胞,待细胞长至80%～90%时进行传代培养,取对数期生长的细胞行转染miR-141慢病毒实验。

1.4细胞的转染和转染效率的鉴定

按照miR-141慢病毒说明书步骤对细胞进行转染。将舌癌细胞分为三组,分别为转染组(miR-141)、阴性对照组(miR-NC)和空白对照组(Blank)。两种舌癌细胞用4×104个细胞接种于6孔板内,放置于37℃培养箱内培养16～24h后细胞完全贴壁形态良好。随后进行miR-141慢病毒转染,慢病毒滴度为8×108TU/mL,按照MOI=50加入相应体积病毒。放置于培养箱内培养12h后更换为常规培养基培养。分别在24、48和72h于荧光显微镜下观察绿色荧光的表达。

用流式细胞术鉴定转染效率。在6孔板内将转染的细胞培养至状态良好,加入胰蛋白酶放置于培养箱内1～2min,轻轻吹打使细胞悬浮。使用RPMI-1640完全培养基终止消化,对悬浮细胞进行计数,细胞数量控制在104～105个之间。转移至流式管内,上机检测转染效率。

1.5细胞划痕实验

准备6孔板,将每个孔底部使用记号笔划线平均分为6个等分。将转染的各组细胞接种5×106个于6孔板内培养。使用10μL移液枪头尖端在细胞中进行划痕,用磷酸盐缓冲液(PBS)将脱壁漂浮的细胞洗净,加入完全培养基,在显微镜下选择最具代表性的位置标记。在同一位置拍摄0h、12h、24h划痕图片。

1.6迁移和侵袭实验

迁移实验:将饥饿24h的细胞悬液计数,在Tanswell小室的上室中加入105个细胞,上室共200μL无血清培养基。下室加入含10%血清的1640完全培养基600μL。放置于培养箱内培养48h,对细胞进行固定、染色。侵袭实验:Matrigel胶和无血清1640培养基按照1∶8比例配制,铺于上室中放入37℃培养箱内4～5h。将饥饿24h后的细胞进行悬浮计数,在上室中加入105个细胞,上室加入200μL无血清培养基。下室加入含10%血清的1640完全培养基600μL置于培养箱内培养48h对细胞进行固定、染色。

1.7荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-141基因表达

收集待检测细胞,使用miRNA提取试剂盒提取细胞中的miRNA。总RNA浓度和纯度用NanoDrop1000分光光度计检测。按照miScript®IIRTKit反转录试剂盒步骤,得到cDNA,将其加入miScript®SYBR®GreenPCRKit中,按照说明书行RT-qPCR扩增(引物序列见表1)。实验条件:95℃(15min),94℃(15s),60℃(30s),70℃(30s),共循环40次。采用2-ΔΔCt法分析检测目的基因的相对表达量。

表1PCR引物序列

1.8荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MMP2、MMP9和zeb2mRNA的表达

使用TRIzol法从细胞中提取总RNA,RNA的纯度和浓度检测用NanoDrop1000分光光度计。按照Thermo反转录试剂盒步骤将总RNA反转录为cDNA,用-20℃冰箱储存cDNA或直接用于实验。使用SYBR®GreenPCRKit试剂盒按照说明书步骤检测MMP2、MMP9和zeb2基因表达(引物序列见表1),GAPDH作为内参基因。反应条件:95℃(2min),94℃(5s),57℃(10s),共循环40次。

1.9Westernblot检测MMP9、MMP2和zeb2蛋白表达

蛋白表达使用Westernblot法检测。将各组细胞裂解提取总蛋白,用BCA法对蛋白定量后加入一定体积4×蛋白上样缓冲液,在-80℃冰箱储存样品。Westernblot实验每个泳道加入20μg蛋白样品,先80V电泳15min,后调至100V电泳90min,电泳结束后转膜至PVDF膜上,在100V、2h条件下湿化转膜。转膜结束后使用5%的脱脂奶粉进行孵育2h。分别以1∶1000、1∶10000、1∶750、1∶1000、1∶10000浓度加入兔抗人MMP9、zeb2、GAPDH单克隆抗体和鼠抗人MMP2抗体。4℃摇床孵育过夜,用1×TBST常温下反复冲洗5次。按1∶1500浓度加入二抗兔抗人或鼠抗人抗体孵育2h后使用AP显色液显色。使用ImageJ软件采集图片。

1.10统计学方法

使用SPSS17对实验数据进行分析,数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析法(OneWayANOVA)分析数据,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1成功培养Tscca和Tca-8113细胞并构建了miR-141慢病毒载体细胞

在Tscca细胞中miR-141组转染率为82.4%,miR-NC组为87.3%;在Tca-8113细胞中miR-141组转染率为73.4%,miR-NC组为89.1%(图1A-1B)。miR-141组及miR-NC组的转染效率达70%以上。RT-qPCR显示Tscca(F=106.88,P<0.05)和Tca-8113(F=193.49,P<0.05)细胞中miR-141表达量高于空病毒载体组和空白对照组细胞(图1C-1D)。

图1两种舌癌细胞转染慢病毒后的转染效率及miR-141基因的表达量

2.2划痕实验结果

划痕实验显示:miR-141组相对移动距离慢于对照组细胞(图2A)。Tscca和Tca-8113细胞中高表达miR-141可抑制细胞划痕愈合速度(图2B)。

2.3迁移和侵袭实验结果

迁移和侵袭实验显示:在Tscca和Tca-8113细胞中miR-141组细胞迁移及侵袭数量均少于对照组细胞,经过细胞计数后使用均数±标准差记录迁移及侵袭的细胞数量见表2-3。

图2划痕实验结果

表2迁移实验各组细胞计数

表3侵袭实验各组细胞计数

2.4zeb2基因及蛋白表达

在Tscca和Tca-8113细胞中miR-141组zeb2基因(Tscca细胞:F=2391.25,P<0.05;Tca-8113细胞:F=66.77,P<0.05)和蛋白(Tscca细胞:F=479.87,P<0.05;Tca-8113细胞:F=523.37,P<0.05)表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

2.5MMP2、MMP9基因和蛋白表达

miR-141组MMP2、MMP9基因(Tscca细胞:MMP2:F=28.61,P<0.05;MMP9:F=126.20,P<0.05。Tca-8113细胞:MMP2:F=24.36,P<0.05;MMP9:F=33.604,P<0.05)和蛋白(Tscca细胞:MMP2:F=316.36,P<0.05;MMP9:F=322.29,P<0.05。Tca-8113细胞:MMP2:F=1703.38,P<0.05;MMP9:F=1720.50,P<0.05)表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

图3RT-qPCR和Westernblot检测舌癌各组细胞的zeb2基因和蛋白表达

图4RT-qPCR和Westernblot检测检测舌癌各组细胞的MMP2、MMP9基因和蛋白表达

3、讨论

miRNA是含21～22个核苷酸的非编码RNA,能通过靶向作用靶蛋白从而影响广泛的生物学功能,如细胞增殖、分化和凋亡[15]。miR-200家族成员包括miR-141,其在不同的肿瘤中上调或者下调。有研究指出miR-200家族在人口腔鳞癌中显著下调[14]。本研究发现,在两种舌癌细胞系中miR-141组较对照组zeb2的基因表达降低,Westernblot结果显示miR-141组zeb2蛋白同样表达降低。提示zeb2基因和蛋白表达被高表达的miR-141抑制。同样舌癌细胞中miR-141组MMP2、MMP9基因和蛋白表达量低于对照组,表明高表达miR-141能够抑制MMP2、MMP9基因和蛋白表达。

上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT)进程在正常胚胎发育和癌症转移期间产生运动和侵袭性的细胞,在癌的侵袭性进展中起主要作用。癌细胞中的EMT由zeb1/zeb2、Snail和Twist等转录抑制因子操纵[16]。其中zeb2属于锌指E-box(zeb)蛋白家族,能抑制E-钙黏蛋白基因的转录并在体外诱导EMT[17]。有研究证明EMT进程在头颈部鳞状细胞癌中是由其相关的蛋白质如N-钙黏蛋白和zeb2蛋白的表达诱导的[18]。有报道指出zeb2与EMT相关的蛋白标记物与头颈鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌的预后不良有关[19]。ARUNKUMAR等人研究显示zeb1和zeb2的表达增加可下调miR-200家族基因从而导致EMT激活[20]。本研究发现在舌癌细胞中高表达miR-141导致zeb2基因和蛋白表达降低,但miR-141和EMT过程之间的关系还需要进行更加成体系的实验验证。

基质金属蛋白酶是锌依赖性蛋白酶,其中基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶2(matrixmetalloprotein9,MMP9;matrixmetalloprotein2,MMP2)能降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原,在癌症的侵袭中起着突出的作用。KHABBAZI等人的报道指出在所有的肿瘤细胞中几乎都有MMP9激活或者表达水平升高[21]。PRAMANIK等人的报道指出口腔鳞癌发展的各个阶段都有MMP9逐渐上调或活化[22]。FRIDMAN研究指出MMP2激活MMP9活性[23]。在本实验中舌癌细胞高表达miR-141组MMP2、MMP9基因和蛋白表达降低。

DAI等人在胃癌中的研究结果表明shRNA介导的zeb2敲低导致胃癌细胞的侵袭和迁移数量减少以及MMP2和MMP9蛋白的表达下调[24]。同样本实验也观察到,高表达miR-141的细胞zeb2、MMP2和MMP9基因及蛋白表达下调,但是在舌癌中zeb2、MMP2和MMP9之间是否存在着调节关系以及其与EMT过程是否存在联系还需进一步实验证实。

总之,本实验研究结果显示高表达miR-141能够抑制舌癌细胞中zeb2、MMP2和MMP9基因和蛋白表达,同样减弱细胞的运动能力。miR-141可能成为预测舌癌恶性程度及判断预后的指标。

参考文献：

[3]王健,李军,郭超.microRNA在舌鳞状细胞癌中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2019,27(02):153-156.

黄涛,刘慧,邵博,龚忠诚.过表达miR-141对舌癌Tscca和Tca-8113细胞侵袭､迁移的影响[J].现代肿瘤医学,2021,29(07):1097-1102.

基金:国家自然科学基金(编号:81460439)