原发性肝癌是一种消化道恶性肿瘤，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是其中一种，其致病原因复杂且多样[1]。肝癌的治疗方法有手术、放疗、化疗等，但疗效并不理想，且化疗药物不良反应严重，因此对肝癌的治疗方式还需要不断地探索，寻找新的治疗方法和药物。中药具有多层次、多靶点、协同干预的特点。目前，传统的抗肿瘤治疗结合中医药抑制肿瘤发展逐渐成为治疗HCC的补充和替代疗法[2]。高乌头具有抗肿瘤的药理作用，高乌头中单体成分高乌甲素的氢溴酸盐和硫酸盐等有抗肝癌作用，但作用都不强，其抑瘤率分别为37%[3]和38.42%[4]。高乌三氯甲烷部分为多种生物碱的集合体[5]。本实验旨在通过体内、外实验探讨高乌头三氯甲烷部分抗肝癌活性。

一、材料与方法

1 材料

细胞株人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞LO2,小鼠肝癌细胞H22,均为兰州大学实验室保存。

动物BALB/C小鼠，鼠龄8周，体质量18～22 g, 中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK(甘)2020-0002。本实验经甘肃中医药大学动物伦理委员会批准(伦理批号：2023-544)。

药品与试剂高乌头，购自甘肃省天祝藏族自治县农贸市场，经甘肃中医药大学药学院附属医院杨锡仓主任中药师鉴定为毛茛科乌头属植物高乌头Aconitum sinomontanumNakai的干燥根；高乌头三氯甲烷部分[6](主要含有生物碱，高乌甲素含量不低于35.72%,冉乌头碱含量不低于11.16%),为实验室自制，于4 ℃冰箱保存；顺铂注射液，规格：每支20 mg, 纯度：95%,批号：9K0114B03,齐鲁制药有限公司生产。凋亡试剂盒，购自上海爱必信生物科技有限公司； 0.1%结晶紫染色液，购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自上海酶联生物公司；B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2家族相关X蛋白(Bcl2-associated X ,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、caspase8、caspase9、P53肿瘤蛋白(tumor protein p53,P53)和细胞色素C(cytochrome C oxidase, cytochrome C),均购自武汉博士德生物工程有限公司。

仪器Epoch酶标检测仪，美国赛默飞世尔科技公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[7]

在37 ℃水浴锅解冻细胞后，加入含血清培养基，离心收集细胞沉淀，用含10%血清的培养基吹打成细胞悬液，置于细胞培养瓶后，于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，每隔1 d更换培养液，0.25%胰酶消化传代。

2.2 模型建立[8]

用无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)调整小鼠肝癌细胞H22浓度为5×106cell·mL-1的单细胞悬液，然后随机选取5只雌性小鼠，腹腔注射H22细胞混悬液(每只0.2 mL)进行细胞体内增殖，9 d后无菌操作抽取腹水。用0.9% NaCl稀释，细胞密度为6×106cell·mL-1,小鼠右腋皮下接种0.2 mL。

2.3 分组与给药方法

细胞实验将HepG2细胞分为空白组(0.9%NaCl注射液)和低、中、高实验组(2、4和8 mg·mL-1高乌头三氯甲烷部分),干预24、48和72 h。

动物实验将BALB/C小鼠分为空白组(不构建肿瘤模型，0.9%NaCl注射液)和高、中、低剂量组(构建肿瘤模型，8、4和2 mg·kg-1高乌头三氯甲烷部分),给药方式为灌胃给药，顺铂组(构建肿瘤模型，2 mg·kg-1顺铂)和氢溴酸高乌甲素组(构建肿瘤模型，4 mg·kg-1氢溴酸高乌甲素),给药方式为腹腔注射，每天给药1次，连续给药14 d。

2.4 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法检测细胞活力[7]

取对数期细胞，调整细胞密度为每孔3×104个，接种在96孔板上，设置不同药物浓度(1、2、4和8 mg·mL-1高乌头三氯甲烷部分),培养24、48和72 h, 加入MTT 10 μL,4 h后加入二甲基亚砜150 μL,于490 nm波长测定光密度值。计算细胞生长抑制率。

2.5 平板克隆形成实验检测细胞集落形成能力[8]

将HepG2细胞接种在6孔板中，在CO2培养箱中孵育2～4周。用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，用0.1 %结晶紫1 mL染色。用蒸馏水冲洗，晾干。在显微镜(低倍)计数大于10个细胞的克隆数。

2.6 Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡情况[7]

将对数期细胞消化，浓度调整为1×106cell·mL-1,每孔加细胞混悬液1 mL;待细胞贴壁生长后，按“2.3”方法进行分组处理，常规培养48 h后，吸取细胞混悬液到离心管，以2 000 r·min-1离心5 min, 用预冷的PBS洗涤沉淀，相同的条件离心，弃去上清液，取1×Binding Buffer 500 μL重悬细胞，每个管加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶染色液(propidium iodide, PI) 10 μL,涡旋混匀后，室温避光孵育，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.7 肿瘤抑制率的测定[9]

3%戊巴比妥钠麻醉，股动脉取血后，处死动物，完整分离肿瘤，称质量。依据公式计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(%)=(模型组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量)÷模型组平均肿瘤质量×100%

2.8 试剂盒法检测生化指标[10]

按照所购试剂盒说明书检测H22荷瘤小鼠血清中的AFP、恶性肿瘤相关物质群(tumor supplied group of factors, TSGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α,TNF-α)和肝功能指标谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)、谷氨酰转肽酶(gamma glutamyl transferase, GGT)的水平。

2.9 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法观察肿瘤组织的病理变化[10]

取出固定在4%多聚甲醛中的组织，经脱水、浸蜡、包埋后，将包埋好的蜡块切成薄片，然后进行HE染色，于显微镜下观察并扫描。

2.10 免疫组化检测肿瘤组织中凋亡蛋白的相对表达情况

参考文献[11]的方法进行免疫组化操作，检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中的Bax、Bcl-2、caspase3、caspase8、caspase9、P53和cytochrome C蛋白的相对表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。方差齐性的计量资料用

表示，多组间比较用单因素ANOVA分析。

二、结果

1 高乌头三氯甲烷部分对细胞增殖的影响

将HepG2细胞分为空白组(0.9%NaCl注射液)和低、中、高实验组(2、4和8 mg·mL-1高乌头三氯甲烷部分),干预24、48、72 h。BALB/C小鼠作为对照组(灌胃给予0.9%NaCl注射液)。将构建模型后的小鼠分为模型组(灌胃给予0.9%NaCl注射液)、高剂量组(灌胃给予8 mg·kg-1高乌头三氯甲烷部分)、顺铂组(腹腔注射2 mg·kg-1顺铂)和氢溴酸高乌甲素组(腹腔注射4 mg·kg-1氢溴酸高乌甲素)。

在给药高乌头三氯甲烷部分24、48和72 h后，得到对HepG2细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC50)分别为5.71、4.37和2.12 mg·mL-1,当药物浓度达到8 mg·mL-1时，对正常肝细胞会产生抑制作用，用药物处理48 h后，得到对LO2细胞的IC50为15.14 mg·mL-1,因此选用1、2、4 mg·mL-1高乌头三氯甲烷部分进行后续研究。

2 高乌头三氯甲烷部分对HepG2细胞集落形成的影响

空白组和低、中、高实验组克隆数分别为108.00±4.00、74.00±3.00、52.00±6.00和37.00±3.00,低、中、高实验组与空白组比较，克隆数随着给药浓度的增大逐渐减少，抑制效果显著增强(P<0.05,P<0.01)。

3 各组细胞凋亡率的比较

空白组和低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为(27.30±0.72)%、(28.63±6.13)%、(31.43±2.01)%和(40.77±3.80)%,高剂量组与对照组比较，在统计学上差异有统计学意义(P<0.05)。

4 各组小鼠肿瘤抑制情况

模型组、顺铂组、氢溴酸高乌甲素组和高剂量组小鼠肿瘤质量分别为(2.50±0.55)、(1.29±0.33)、(1.23±0.34)和(1.19±0.33)g, 抑瘤率分别为48.40%、50.71%和52.58%。顺铂组、氢溴酸高乌甲素组和高剂量组肿瘤质量较模型组均显著降低(均P<0.05)。

5 各组小鼠免疫、炎症因子相关指标的比较

模型组与对照组相比，血清中IL-2水平显著降低(P<0.05);高剂量组与模型组比较，血清中IL-12水平显著升高(P<0.05);顺铂组与模型组比较，血清中IL-2和IL-12的水平均显著升高(P<0.05,P<0.01);顺铂组、氢溴酸高乌甲素组、高剂量组与模型组比较，血清中TNF-α水平均显著升高(P<0.05,P<0.01),见表1。

6 高乌头三氯甲烷部分对肝癌相关指标的影响

模型组与对照组相比，血清中肝癌标志物AFP、TSGF和VEGF水平均显著升高(P<0.05,P<0.01);高剂量组与模型组相比，AFP、TSGF和VEGF水平均显著降低(均P<0.01),见表2。

表1高乌头三氯甲烷部分对H22肝癌荷瘤小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响

表2高乌头三氯甲烷部分对H22肝癌荷瘤小鼠血清中甲胎蛋白(AFP)、恶性肿瘤相关物质群(TSGF)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响

7 高乌头三氯甲烷部分对肝功能相关指标的影响

模型组与对照组相比，血清中GOT和GGT水平均显著升高(P<0.05,P<0.01);高剂量组与模型组相比，血清中GOT和GGT水平均显著降低(P<0.05,P<0.01);顺铂组与模型组比较，血清中GOT水平显著升高(P<0.05),见表3。

表3高乌头三氯甲烷部分对H22肝癌荷瘤小鼠血清中肝功能指标谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)和谷氨酰转肽酶(GGT)的影响

8 肿瘤组织的病理变化情况

模型组肿瘤细胞偶见灶性坏死，顺铂组和高剂量组肿瘤细胞多见坏死细胞碎片，氢溴酸高乌甲素组肿瘤细胞多见网状坏死和灶性坏死，多见坏死的细胞碎片，有少量的淋巴细胞浸润，见图1。

9 肿瘤组织中相关凋亡蛋白的相对表达水平

免疫组化实验显示，模型组、顺铂组、氢溴酸高乌甲素组和高剂量组Bax蛋白相对表达水平分别为48.57 ±15.50、89.09±8.54、60.40±3.24和108.79±3.17,Bcl-2蛋白相对表达水平分别为101.09±7.15、65.92±6.11、67.12±7.88和62.60±10.75,caspase3蛋白相对表达水平分别为46.07±4.37、115.66±20.82、91.01±42.81和110.85±57.67,caspase8蛋白相对表达水平分别为57.07±18.65、97.61±12.89、66.96±25.09和110.70±13.09,caspase9蛋白相对表达水平分别为63.69±16.51、107.74±10.68、93.31±6.80和111.23±17.66,P53蛋白相对表达水平分别为4.28±2.74、15.65±5.59、11.20±2.18和14.83±3.52,CytC蛋白相对表达水平分别为65.02±5.94、106.51±11.94、96.43±19.81和110.85±9.77。顺铂组、高剂量组与模型组相比，肿瘤组织中P53、Bax、caspase3、caspase8、caspase9和CytC蛋白相对表达水平均显著升高(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.01)。

图1各组小鼠肿瘤组织病理形态变化(苏木精-伊红染色，×200)

三、讨论

生物碱的主要通过调节机体免疫、抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等机制发挥抗肝癌作用[12]。高乌头中生物碱成分主要集中在三氯甲烷部分。本研究结果表明，经高乌头三氯甲烷部分给药后，肝癌HepG2细胞活率降低，凋亡率升高，并且能抑制H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤的生长。

细胞凋亡在癌症的治疗中发挥着重要作用，几乎所有的抗肿瘤药物都能够通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌作用。研究表明，高乌头中单体成分高乌甲素及其衍生物能够抑制HepG2细胞增殖，并促进其凋亡[4]。本课题组前期研究对高乌头炮制前后的抗肝癌活性进行比较，发现高乌头炮制后三氯甲烷部分抑制肝癌HepG2细胞增殖作用较弱，所以本研究选择了生品进行研究。本研究发现，高乌头三氯甲烷部分能抑制HepG2细胞增殖和促进其凋亡。这表明高乌头三氯甲烷部分是多种生物碱共同发挥抗肝癌的作用。

本研究结果表明，高乌头三氯甲烷部分具有显著的抗肝癌活性，可抑制肝癌细胞的增殖，诱导其凋亡，从而发挥抗肝癌活性。

参考文献:

[2]龙飘,房盛懿,杨雨莹,等.基于虚实辨证探讨中药干预肝癌炎性微环境的研究进展[J].中药新药与临床药理,2023,34(7):1010—1016.

[3]林妮,肖柳英,林培英,等.氢溴酸高乌甲素抗肿瘤的实验研究 [J].中医研究,2005,18 (10):16—18.

[4]马君义,韩小芬,陈香玲,等.硫酸高乌甲素对人肝癌HepG2细胞增殖､凋亡与细胞周期的影响 [J].中成药,2017,39 (9):1940—1942.

[5]李芸,苗小楼,张立军,等.高乌头不同溶剂萃取部分HPLC多波长指纹图谱与其急性毒性的谱-毒研究[J].中国药学杂志,2018,53(22):1936—1943.

[6]张立军,戴海蓉,杨志军,等.高乌头炮制前后镇痛抗炎活性部位HPLC指纹图谱建立及质量研究[J].中草药,2017,48(12):2442—2447.

[7]秦冬梅,姚佳,孟凌宇,等.新疆软紫草提取物对HepG2细胞凋亡的影响及其抗小鼠原位肝癌的作用[J].中国药理学通报,2023,39(7):1312—1319.

[8]胡娜,盛磊,饶辉,等.淫羊藿素对肝癌HepG2细胞的抗增殖作用及其机制研究[J].中国临床药理学杂志,2022,38(16):1887—1891.

[9] 朱洪卿,韦爽,吕美娴,等.裂果薯总皂苷对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及其机制的初步研究[J].中国药学杂志,2021,56(6):478—483.

[10]于凌慧,赵谭军,陈思梦,等.皮氏蛾螺黏液粗蛋白对肝癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响[J].大连海洋大学学报,2022,37(4):592—601.

[11]杨玉萍,段永强,梁建庆,等.参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠抑瘤作用的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(14):2069—2073.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82360773);甘肃省重点研发计划基金资助项目(20YF2FA019);甘肃中医药大学研究生创新创业基金资助项目(2022CX84);

文章来源:魏家艳,贾春艳,张国玉,等.高乌头三氯甲烷部分对肝癌细胞的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(24):3568-3572.