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药根碱通过下调MAOB表达抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭

2025-01-13 87 上传者：管理员

摘要：目的探讨药根碱对骨肉瘤发展的作用及其机制。方法通过网络药理学分析筛选药根碱对骨肉瘤作用靶点, GSEA富集分析单胺氧化酶B (monoamine oxidase B, MAOB)表达与骨肉瘤临床表型间的关系;检测药根碱不同剂量(0、 2、 4、 8、 16μmol/L)作用下骨肉瘤细胞MG63、 U2OS细胞活性,选取后续功能试验药根碱剂量, CCK-8法、 Transwell实验分别检测MG63、 U2OS细胞增殖、迁移和侵袭,蛋白质印迹检测增殖细胞相关抗原Ki67、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2, MMP2)、 MMP9蛋白表达;建立裸鼠骨肉瘤皮下移植模型,测算各组肿瘤组织质量、体积,免疫组化检测Ki67表达;蛋白质印迹检测药根碱对骨肉瘤细胞MABO蛋白表达影响;采用sh RNA干扰MAOB表达,并检测其对骨肉瘤细胞增殖影响。结果网络药理学预测出包括MAOB在内药根碱对骨肉瘤作用靶点10个, GSEA富集分析表明MAOB与骨肉瘤预后情况(P<0.05)及生存期相关(log-rankP<0.05); MG63、 U2OS细胞存活能力随着药物剂量增加而降低,当药根碱剂量为8μmol/L时,骨肉瘤细胞存活能力降低约50%,故选择8μmol/L进行后续功能实验;体外实验显示与Control组比较,药根碱组细胞增殖速率显著降低(P<0.05),侵袭和迁移细胞数量显著降低(P<0.05), Ki67、 MMP2、 MMP9蛋白水平显著下调(P<0.05);体内实验显示,药根碱组裸鼠皮下瘤生长速度显著降低(P<0.05),皮下瘤质量和体积均降低(P<0.05),肿瘤组织中Ki67表达水平显著降低(P<0.05)。药根碱在体外呈时间和浓度依赖性抑制骨肉瘤细胞MAOB表达(P<0.05)。与sh NC组比较,敲低MAOB组能显著抑制骨肉瘤细胞增殖(P<0.05);转染过表达MAOB载体可逆转药根碱对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用(P<0.05)。结论 MAOB表达水平与骨肉瘤预后和生存相关, MAOB促进细胞增殖、侵袭和肿瘤转移;药根碱通过抑制MAOB表达抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移。

关键词：
单胺氧化酶B
细胞侵袭
细胞增殖
细胞迁移
药根碱
骨肉瘤
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骨肉瘤是在儿童和青少年中最常见的骨癌,骨肉瘤转移或复发患者5年生存率低于30%[1]。在过去40年里,骨肉瘤未转移患者生存率没有显著改善,骨肉瘤已转移患者生存率并无改善[2]。由于骨肉瘤是一种与其微环境和免疫系统相互作用的复杂疾病,其发病受到多种因素影响[3],其机制目前尚无定论,使专门针对肿瘤细胞的分子靶向疗法开发更加困难,也凸显了开发新治疗策略的迫切需要。药根碱是从黄连、木防己等植物中提取出的一种结构与小檗碱类似的异喹啉类生物碱,其药理作用也与小檗碱相似[4],Huang等[5]发现,药根碱可通过抑制铁凋亡相关基因抑制结直肠癌生长。但目前药根碱是否与骨肉瘤的发病发展相关尚未得到证实。因此本研究探讨了猜测药根骨肉瘤细胞迁移和侵袭的作用,通过网络药理学和体内、外实验验证并探讨其作用机制,现报道如下。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞及实验动物

人骨肉瘤细胞MG63、U2OS细胞株(美国ATCC细胞库);BALB/c雄性裸鼠12只,SPF级,6周龄,体质量18～22 g,许可证号SCXK (冀) 2022-001 (河北省实验动物中心)。

1.1.2主要试剂

药根碱(HPLC≥98%,北京索莱宝科技有限公司),MAOB sh RNA载体、过表达载体设计和构建(上海锐赛生物技术有限公司),单胺氧化酶B (monoamine oxidase B,MAOB)、增殖细胞相关抗原Ki67、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP) 2、MMP9、一抗(美国Sigma公司),Ig G二抗、DMEM培养基、胎牛血清FBS、CCK-8检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),Lipofectamine 2000试剂盒(美国Thermofisher公司),Matrigel基质胶(美国BD boicoat公司)。

1.2网络药理学

在Target Net数据库(http://targetnet.scbdd.com/)以Prob>0为条件预测药根碱的作用靶点;GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2 r/)软件分析GES14359数据集骨肉瘤表达上调的基因,二者取交集。利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库,下载TARGET＿OS数据矩阵和临床信息,进一步分析交集基因与骨肉瘤恶性临床表型的关系,GSEA 4.0软件富集分析靶点基因与细胞增殖、侵袭和肿瘤转移关系。

1.3细胞培养与转染

使用DMEM培养基培养骨肉瘤MG63、U2OS细胞,培养箱条件为:37℃5%CO2。细胞培养至汇合率70%～90%时开始转染,用DMEM培养基稀释sh RNA,再以1∶1比例混匀sh RNA和转染试剂,室温孵育5 min,将sh RNA转染混合液加入细胞中过夜,另设sh NC组转染对照载体。

1.4皮下移植瘤裸鼠模型建立

将12只裸鼠随机分为Control组和药根碱组,每组6只,将MG63细胞(2×106个)皮下注射至小鼠右侧腋下,7 d后开始药物干预,药根碱组每日腹腔注射药根碱溶液(3.75 mg/kg),Control组每日腹腔注射等体积生理盐水,治疗14 d,每2天测算1次皮下瘤体积,第14天治疗1 h后以4%水合氯醛麻醉处死小鼠,取皮下瘤组织称重并测算体积后,固定于4%多聚甲醛中。肿瘤体积=0.5×最长直径×最短直径2。

1.5 CCK-8实验检测细胞增殖

用10%FBS DMEM培养基分别重悬MG63、U2OS细胞后接种于96孔板中,密度为5×103,继续培养24 h,分别加入不同剂量(0、2、4、8、16μmol/L)药根碱继续培养24 h,加入10μL CCK-8溶液,孵育2 h后于酶标仪以450 nm波长测定各孔吸光度,根据细胞活力选择后续功能试验给药剂量。将细胞分为Control组和药根碱组,其中药根碱组采用上述方法选择出的最佳剂量进行干预,并以相同方法分别24、48、72、96、120 h后细胞增殖情况。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移

将经药根碱干预48 h后的MG63、U2OS细胞换用无血清DMEM培养基培养过夜,调整细胞数量至2×105个/m L。Matrigel胶提前取出于4℃过夜,用无血清DMEM培养基稀释至300μL/m L,铺于Transwell小室培养池PET膜上,将培养池放入24孔板中37℃置3 h,于超净台过夜干燥。第二天在24孔板底部加入含10%FBS的DMEM培养基,将MG63、U2OS细胞分别接种于Transwell小室上室培养24 h,再用70%甲醇溶液浸泡Transwell小室的下室,固定60 min,0.1%结晶紫染色5 min,显微镜下观察并计数为细胞侵袭数量。Transwell小室PET膜不铺Matrigel胶,其余步骤相同,计数为细胞迁移数量。

1.7蛋白质印迹检测蛋白表达

提取MG63、U2OS细胞总蛋白,采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,根据待测蛋白分子量配置凝胶并电泳、转模,用5%脱脂牛奶震荡封闭2 h,PBS清洗3×10 min,4℃震荡孵育一抗过夜,PBS清洗3×10 min,震荡孵育二抗2 h,PBS清洗3×10 min,ELC显影并成像。

1.8免疫组化检测Ki67表达

将固定于多聚甲醛中的肿瘤组织块修剪成合适大小,制成石蜡切片,常规脱蜡后修复抗原,用稀释血清37℃封闭30 min,加一抗4℃过夜,PBS清洗3×5 min,加二抗37℃孵育1 h,PBS清洗3×5 min,加稀释后的链霉亲和素-生物素复合物37℃孵育30 min后进行显色,苏木精复染,梯度酒精脱水,封片,显微镜下观察并计数,阳性细胞呈棕黄色。

1.9统计学方法

所有试验均重复3次,数据分析采用SPSS20.0软件,数据可视化采用Graphpad Prism 6软件,计量资料以表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较使用单因素方差分析,组间两两比较使用t-LSD法。

2、结果

2.1网络药理学预测药根碱对骨肉瘤作用靶点

Target Net数据库预测药根碱作用靶点81个,GEO2R分析出骨肉瘤表达上调的基因1552个,二者有10个共同基因(表1);分析TARGET＿OS数据矩阵和临床信息,结果显示,在这10个基因中,MAOB与骨肉瘤预后情况及生存期相关(P<0.05、log-rankP<0.05)。以MAOB表达水平的中位数分组,将骨肉瘤患者分为MAOB高、低两组,GSEA 4.0软件分析MAOB表达水平与细胞增殖、侵袭和肿瘤转移关系,结果表明,MAOB促进细胞增殖、侵袭和肿瘤转移(P<0.05)。

表1骨肉瘤差异表达基因

2.2药根碱抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

在CCK-8实验中,MG63、U2OS细胞存活能力随着药物剂量增加而降低,当药根碱剂量为8μmol/L时,骨肉瘤细胞存活能力降低约50%(图1A～B),因此选择8μmol/L进行后续功能实验。与Control组比较,药根碱细胞增殖速率显著降低(P<0.05,图1C、D),侵袭和迁移细胞数量显著降低(P<0.05,图1E、F),Ki67、MMP2、MMP9蛋白水平显著下调(P<0.05,图1G)。

图1药根碱抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

A、B:不同剂量药根碱对骨肉瘤细胞生存抑制影响;C、D:药根碱对骨肉瘤细胞增殖影响;E、F:药根碱对骨肉瘤细胞侵袭、迁移影响(×200);G:蛋白质印迹检测骨肉瘤细胞Ki67、MMP2、MMP9蛋白表达。1:Control组;2:药根碱组。与Control组比较,*P<0.05。

2.3药根碱体内抑制骨肉瘤细胞增殖

通过建立皮下移植瘤裸鼠模型,观察药根碱在体内对骨肉瘤细胞增殖的作用。造模过程中,2组各有一只裸鼠在皮下注射7 d后未能生长出显著皮下瘤,予以剔除,最终2组均为5只裸鼠纳入统计。

与Control组比较,药根碱组裸鼠皮下瘤生长速度显著降低(P<0.05,图2A),Control组和药根碱组皮下瘤体积分别为(613.06±34.24) mm3、(312.05±35.32) mm3,皮下瘤治疗分别为(0.50±0.02) g、(0.22±0.02) g,肿瘤组织中Ki67表达水平分别为(1.00±0.02)、(0.24±0.02),药根碱组皮下瘤质量、体积、肿瘤组织中Ki67表达水平(图2B)均低于Control组(P<0.01)。

图2药根碱体内抑制骨肉瘤细胞增殖

2.4药根碱抑制MAOB的表达,低表达MAOB抑制骨肉瘤细胞增殖

药根碱在体外呈时间和浓度依赖性抑制骨肉瘤细胞MAOB表达(P<0.05,图3A～C),经sh RNA干预敲低MAOB后,与sh NC组比较,敲低MAOB能显著抑制骨肉瘤细胞增殖(P<0.05,图3D、E)。

图3药根碱抑制骨肉瘤细胞MAOB表达及细胞增殖

2.5药根碱通过MAOB抑制骨肉瘤细胞增殖

药根碱在体外能显著抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移(P<0.05),转染过表达MAOB载体可逆转药根碱的抑制作用(P<0.05)(图4)。

图4药根碱通过MAOB抑制骨肉瘤细胞增殖

A:蛋白质印迹检测MAOB蛋白表达;B、C:药根碱和过表达MAOB对骨肉瘤细胞增殖影响;D、E:药根碱过表达MAOB对骨肉瘤细胞侵袭、迁移影响(×200)。与Control组比较,*P<0.05。

3、讨论

药根碱是一种原小檗碱生物碱,常被用作解毒降糖药,也具有抗炎、抗氧化等多种药理作用[6-7]。药根碱可以抑制肿瘤细胞增殖,研究表明药根碱可在体外抑制胃癌细胞株的生长[8]。Ki67蛋白表达水平与恶性肿瘤细胞增殖活性相关,可用作肿瘤侵袭性的标志物[9]。MMP是调节上皮间质转化主要酶类,MMP2、MMP9参与乳腺癌细胞增殖、侵袭[10]。本研究通过体外细胞实验发现随着药根碱剂量增加,骨肉瘤细胞活力逐渐降低,下调骨肉瘤细胞中Ki67、MMP2、MMP9蛋白表达,且对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移均具有抑制作用,在体内实验中,通过建立皮下移植瘤裸鼠模型,发现药根碱可抑制皮下瘤生长速度,下调肿瘤组织中Ki67表达,说明药根碱在体内、外均对骨肉瘤细胞增殖有抑制作用。

虽然我们已经明确了药根碱对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用,但其作用机制尚不清楚。本研究利用网络药理学方法预测药根碱对骨肉瘤的作用靶点,发现MAOB是骨肉瘤的差异表达基因,其表达水平与骨肉瘤预后、生存期相关,且促进细胞增殖、侵袭和肿瘤转移。MAOB主要位于线粒体外膜,能催化单胺神经递质的氧化脱氨,在神经系统疾病中研究较多[11-12]。有研究发现,MABO可促进前列腺癌的生长和发展,与其预后相关,结直肠癌细胞中MAOB高表达且与高复发率和不良预后显著相关,与间充质型和上皮型基因表达的显着相关[13-14]。本研究通过体外实验发现药根碱呈剂量和时间依赖性抑制骨肉瘤细胞MAOB表达,敲低MAOB可显著抑制骨肉瘤细胞增殖,而药根碱抑制MAOB表达后,骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移也被抑制,经过表达MAOB载体干预后,药根碱对骨肉瘤细胞的抑制作用被逆转,表明药根碱通过靶向MAOB抑制骨肉瘤细胞增殖。

综上所述,MAOB表达水平与骨肉瘤预后和生存相关,MAOB促进细胞增殖、侵袭和肿瘤转移;药根碱通过抑制MAOB表达抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移。

参考文献:

[3]木特力·买买提,徐磊磊,李文强,等.中性粒细胞胞外诱捕网通过CCDC25促进骨肉瘤细胞增殖､迁移和侵袭的作用研究[J].医学分子生物学杂志,2024,21(2):129-134.

[9]王萍,黄欢,陈光祥.体素内不相干运动扩散加权成像预测胶质瘤Ki-67表达水平的应用价值[J].西南医科大学学报,2024,47(5):438-441+451.

[10]陈竞,高砚春.姜黄素调控PTEN/mi R-182-5p轴抑制乳腺癌发生发展的机制研究[J].分子诊断与治疗杂志,2024,16(11):2099-2102,2111.

基金资助:2022年度河北省医学科学研究课题计划(No.20220558)~~;

文章来源:李霄雯,赵洁,江丽强,等.药根碱通过下调MAOB表达抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):29-34.