摘要:目的:研究辛伐他汀对体外人鼻咽癌细胞CNE-2增殖抑制、细胞凋亡及侵袭转移的影响,并对其潜在作用机制进行研究探讨。方法:采用MTT实验测不同浓度梯度辛伐他汀(0、0.1、1、10mmol/L)对CNE-2细胞增殖抑制作用;细胞凋亡情况的检测采用流式细胞术,Transwell实验检验细胞侵袭迁移能力,Westernblot检测细胞中Bax、Bcl-2、AMPK、pAMPK、mTOR蛋白表达水平,检测分析丙二醛量(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的前后变化。结果:与对照组相比,辛伐他汀对CNE-2细胞的增殖抑制率明显升高,凋亡率明显升高,且侵袭转移能力明显降低,具有明显的剂量和时间依赖关系,差异均具有统计学意义(P<0.05),此外,与对照组相比,辛伐他汀能够显著增强Caspase-3的活性,使得AMPK/pAMPK/Bax蛋白表达增加,mTOR/Bcl-2蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。辛伐他汀能够增加MDA含量,减少SOD活性,以上作用均具有剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:辛伐他汀对鼻咽癌细胞增殖抑制、诱导细胞凋亡和抑制侵袭转移的作用,可能与AMPK/mTOR通路及氧化应激有关。
鼻咽癌临床常见,恶性程度高,治疗手段主要为手术及放化疗。但术后容易复发,预后差,严重威胁病患生命健康。虽然目前有新型化疗药物使用,但临床实际应用效果仍差,寻找有效的抗鼻咽癌药物,仍是鼻咽癌治疗的重要研究方向。
辛伐他汀(SIM)是一个经典的降血脂药物,近年来,多项研究显示,辛伐他汀能够降低病人肿瘤的发病率,甚至可以提高恶性肿瘤病人的生存率,进而引起研究者们广泛兴趣[1,2,3]。研究发现,辛伐他汀具有抗肿瘤细胞生物活性,在体内外均能抑制肿瘤细胞的生长,并且能够增强肿瘤放化疗的敏感性[4,5]。目前辛伐他汀已被用于多项癌症病人的临床治疗研究[6]。有研究发现,辛伐他汀能够抑制鼻咽癌细胞生长及促进凋亡,但是机制不明[5,7]。因此为观察辛伐他汀对鼻咽癌的抗肿瘤作用,本文的研究对象为人鼻咽癌CNE-2细胞,并通过临床药物辛伐他汀作用观察药物对鼻咽癌CNE-2细胞的生命周期影响状况。
AMPK/mTOR信号通路和氧化应激在肿瘤生长、代谢、凋亡过程等过程中作用关键,有报道显示,辛伐他汀通过调控AMPK/mTOR信号通路、氧化应激系统对肺癌、胰腺癌起诱导凋亡的作用。目前辛伐他汀抗肿瘤的研究多见于乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等等,关于辛伐他汀与鼻咽癌相关研究较少[8],本研究进一步观察了辛伐他汀对鼻咽癌细胞的的作用及其与AMPK/mTOR信号通路和氧化应激的关系,为进一步临床研究和应用提供基础。
1、材料与方法
1.1CNE-2细胞培养及传代
本文所选用的试验材料为本单位保存的人鼻咽癌细胞CNE-2,细胞培养液主要组成成分为10%胎牛血清,去定量的人鼻咽癌细胞CNE-2并将其置于37℃,含5%CO2的恒温培养箱中进行培养,人鼻咽癌细胞CNE-2为单层贴壁生长。隔两天传代,试验中以对数生长期细胞进行处理。
1.2主要仪器与试剂
辛伐他汀、DMSO、MTT等试剂和药物均采购于美国Sigma公司,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞检测试剂盒采购于美国Invitrogen公司,Gallios流式细胞仪,Caspase-3检测试剂盒则采购于碧云天生物技术研究所,考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购于上海美季生物技术有限公司;SDS-聚丙烯酰胺、PBST溶液、GIS-2020D凝胶图像分析系统采购于Sigma公司;试验中所用的抗体如:bcl-2、bax、AMPK、pAMPK及mTOR等抗体均采购于美国Abcam公司。
1.3MTT测细胞存活率
提取本单位培养的对数生长期CNE-2细胞并在其中加入胰酶予以处理,随后完成计数和调整密度等工作,在孔板中进行接种,当CNE-2细胞贴壁后去除原培养液并向其中加入含药物的新培养液,试验用药物为辛伐他汀稀释液,实验分为4组,各组中辛伐他汀终浓度分别为0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、10mmol/L,其中辛伐他汀0mmol/L为对照组,在细胞培养24h、48h、72h时添加,并向孔板中加入5mg/mLMTT每孔20μL,静置4h后弃上清液并向其中加入150μL的DMSO随后进行振荡,在波长为570nm的光源照射下测吸光度值。试验重复三次。
1.4AnnexinV-FITC/PI流式细胞仪检测
提取本单位培养的对数生长期CNE-2细胞并将细胞浓度为5×104/mL的进行接种处理,采用不同浓度辛伐他汀对每组细胞作用相同时间,均为48h,并向其中按1×106/mL密度混入缓冲液重悬,根据AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒测试指导说明完成相应的检测操作,加入5μlLAnnexinV-FITC,避光10min后在离心机中进行离心处理,弃上清,并加入缓冲液重悬,加入10μlLPI染色液充分混合后在温度为4℃的恒温箱中进行避光染色15min,处理完成后在0.5h内完成检测。试验重复三次。
1.5Transwell实验测细胞侵袭迁移能力
CNE-2细胞接种于24孔板,调整细胞浓度为2×105/mL,加入药物处理48h后,在Transwell小室上、下室之间的微孔膜上铺上Matrigel溶液50μL,并置于温度为37℃恒温箱中完成聚合,聚合时间为30min。随后将不同实验组细胞进行洗涤和消化。在完成细胞收集后分别置于培养箱中培养1d,向每组中加入0.5%结晶紫染液并完成室温孵育10min。去基质胶和上室内细胞,观察并统计穿过滤膜的细胞个数,随机选取5个视野计数均值。迁移能力测定则transwell小室上室无需采用Matrigel溶液包被,其余步骤同前。
1.6Westernblot方法检测辛伐他汀对人鼻咽癌细胞CNE-2的BAX、BCL-2、AMPK、pAMPK、mTOR等相关蛋白的表达影响
提取本单位培养的对数生长期CNE-2细胞并将浓度为5×104/mL的细胞接种于培养皿中,采用药物作用细胞48h,向其中加入胰酶完成消化收集,将收集的细胞作为观察组并取与收集细胞等量的蛋白质进行12%SDS-PAGE凝胶电泳处理,并转入PVDF膜向其中加入5%脱脂奶粉,随后置于恒温4℃保温箱中过夜,将封闭过夜的细胞稀释于0.5%BSA液中,在印迹膜室温孵育2h并取出,利用TBST洗膜10min×3次,然后用0.5%BSA液稀释的二抗与印迹膜在室温孵育2h加入TBST液洗膜15min×3次,通过凝胶成像仪进行成像观察分析。
1.7辛伐他汀对CNE-2鼻咽癌细胞中丙二醛量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
取对数生长期细胞CNE-2,用0.5%的胰蛋白酶消化,并以培养液调整成1×105/mL的单细胞悬液。按2mL/孔接种单细胞悬液于6孔细胞培养板,置37℃培养箱中培养48h。然后换含有辛伐他汀的培养液,浓度同前,培养48h后收集细胞,采用超声波破碎(功率300w,破碎25s,间歇25s)。离心收集上清,选用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别对MDA和SOD进行检测,蛋白含量采用brandford法进行测定。
1.9统计分析
上述试验所得数据通过Mean±SD予以表示,并采用SPSS17.0软件完成统计学检测,服从正态分布的数据采用单因素方差分析(One-wayANOVA)中Tukey's法完成比较,以P<0.05为有统计学差异,P<0.01为有高度统计学意义。
2、结果
2.1MTT测辛伐他汀对CNE-2细胞存活率的影响
以对照组存活率作为100%,辛伐他汀0.1mmol/L作用24h、48h、72h人鼻咽癌CNE-2细胞存活率分别为88.3%±3.72%、82.4%±4.59%、78.3%±5.29%。辛伐他汀1mmol/L作用24h、48h、72h存活率分别为80.8%±5.14%、73.7%±4.98%、60.8%±6.38%。辛伐他汀10mmol/L作用24h、48h、72h存活率分别为66.3%±4.85%、57.3%±5.24%、45.7%±7.26%。使用辛伐他汀处理后,CNE-2的细胞存活率显著下降,且细胞存活率对照组>辛伐他汀0.1mmol/L>1mmol/L>10mmol/L,辛伐他汀各组细胞存活率24h>48h>72h,说明辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞具有一定抑制功能,且药物浓度和作用时间同抑制人鼻咽癌CNE-2细胞增值效果呈现正相关关系。其中,辛伐他汀浓度为0.1mmol/L作用24h及48h与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),其余各组与对照组相比均具有显著统计学意义(P<0.01)(见图1)。
图1MTT测辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞存活率的影响(%)
2.2AnnexinV-FITC/PI流式细胞仪检测辛伐他汀对CNE-2细胞凋亡率的影响
对照组细胞凋亡率2.5%±0.5%,药物浓度分别为0.1、1、10mmol/L时凋亡率分别为6.1%±1.3%、24.3%±3.9%、44.1%±4.8%,结果表明辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞具有抑制增值和诱导细胞凋亡的作用,且诱导效果同药物浓度与作用时间呈正相关关系。辛伐他汀各组凋亡率与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)(见图2,3)。
图2流式细胞仪测辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡率的影响
图3不同浓度辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡率的比较
2.3辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞侵袭转移的影响
随着辛伐他汀药物浓度不断升高,鼻咽癌CNE-2细胞迁移细胞数和侵袭细胞数也明显减少,均少于对照组。辛伐他汀0.1mmol/L与对照组相比具有统计学差异(P<0.05);辛伐他汀1、10mmol/L与对照组相比具有显著统计学差异(P<0.01)。此结果提示辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞的侵袭和转移具有抑制作用(见图4)。
图4辛伐他汀对CNE-2细胞迁移侵袭细胞数的影响
2.4辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞AMPK/pAMPK/mTOR/BAX/Bcl-2蛋白表达的影响
AMPK是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是胆固醇合成和脂肪代谢关键酶的上游调节因子,在能量代谢中起着非常重要的调控作用,又被称为“能量传感器”[18]。辛伐他汀对CNE-2细胞蛋白表达的影响程度为:CNE-2细胞在药物浓度分别为0、0.1、1、10mmol/L的条件下,AMPK/pAMPK/BAX和mTOR/Bcl-2表达分别随药物浓度增高而逐渐上升和下降,观察组和对照组的比较差异具有统计学意义(见图5)。
图5辛伐他汀对CNE-2细胞各蛋白表达量的影响
2.5辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞MDA含量及SOD活力的影响
鼻咽癌CNE-2细胞MDA含量随着辛伐他汀浓度升高而升高,SOD活力随着辛伐他汀浓度升高而下降,其中,辛伐他汀浓度为0.1mmol/L与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),辛伐他汀浓度为1、10mmol/L与对照组相比均具有显著统计学意义(P<0.01)(见图6)。
图6辛伐他汀对CNE-2细胞MDA及SOD活性的影响
3、讨论
鼻咽癌是临床常见头部恶性肿瘤,发病率逐年增长,病人家庭和社会负担沉重。目前,鼻咽癌治疗多为手术、化疗、放疗及分子靶向治疗模式,但五年生存率低,治疗效果欠佳[9]。临床鼻咽癌病人的治疗迫切需要寻找有效的抗鼻咽癌药物。
辛伐他汀(simvastatin,SIM)是一个经典的降血脂药物,近年来,多项研究显示,辛伐他汀能够降低病人肿瘤的发病率,甚至可以提高恶性肿瘤病人的生存率,进而引起研究者们广泛兴趣,成为研究热点[9,10]。研究发现该药物在临床治疗鼻咽癌具有抑制肿瘤细胞生长的作用,目前辛伐他汀已被用于多项癌症病人的临床治疗研究[11]。
BAX和BCL-2是BCL-2基因家族中常见的促进细胞凋亡的蛋白质,对于控制肿瘤细胞凋亡具有重要作用。本研究显示,同对照组相对,观察组采用辛伐他汀(0.1、1、10mmol/L)作用于鼻咽癌CNE-2细胞后细胞存活率显著下降,凋亡率升高(P<0.05),且试验效果具有剂量-反应关系,不仅如此该药物作用后还能增强Caspase-3的活性,促使BAX蛋白过量表达,并抑制Bcl-2蛋白表达水平,试验结果表明辛伐他汀可用于临床治疗鼻咽癌,与其他报道相符[12]。
AMPK/mTOR信号通路在细胞增殖、存活、凋亡、糖代谢、基因转录和细胞迁移中扮演了重要的角色,AMPK作为一种抑癌基因蛋白,是目前肿瘤研究的靶点之一,激活AMPK能够抑制mTOR的磷酸化,发挥抗肿瘤效应,能够影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等多种生物学行为[13]。研究显示,辛伐他汀能够作用于AMPK/mTOR途径进而起到抗胶质瘤、卵巢癌、肝癌等肿瘤作用。本研究显示,辛伐他汀能够使得AMPK及pAMPK蛋白表达增加,mTOR蛋白表达水平降低,观察组和对照组试验结果差异具有统计学意义(P<0.05),说明辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制增殖、诱导凋亡的作用可能与AMPK/mTOR通路有关。
丙二醛(MDA)反映氧自由基对组织细胞的损害程度,超氧化物歧化酶(SOD)能够清除氧自由基,两者是氧化应激系统的标记性物质。本研究结果表明,辛伐他汀能够增加MDA含量,减少SOD活性,由此可见辛伐他汀抗鼻咽癌作用可能与氧化应激有关。综上所述,辛伐他汀对鼻咽癌细胞增殖抑制、诱导细胞凋亡和抑制侵袭转移(下转第303页)的作用,可能与AMPK/mTOR通路和氧化应激有关。本研究为鼻咽癌的治疗提供新的思路,还有待进一步深入研究和探讨。
参考文献:
[13]郭阗廷,熊丽娇,陈丽.二甲双胍对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用研究[J].赣南医学院学报,2018;(08):749-752
陈洪昌,廖蕾,周光耀,张惠琴.辛伐他汀通过AMPK/mTOR信号通路及氧化应激对鼻咽癌细胞凋亡和侵袭转移的作用研究[J].内蒙古医科大学学报,2020,42(03):288-291+303.
基金:2016年四川省卫生和计划生育委员会科研课题(16PJ057)
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