肾细胞癌(RCC)又称为肾腺癌，主要在肾小管上皮上发病，占肾脏恶性肿瘤的80%～90%,其中绝大多数RCC被诊断为肾透明细胞癌(ccRCC)[1,2]。ccRCC是RCC最常见的亚型，80%～85%患者在诊断初期已经发生转移，并且传统的放疗和化疗手段对ccRCC的治疗并不理想[3,4]。因此，迫切需要研究分析ccRCC发展和转移的机制，寻找新的生物标志物和研发更有效的治疗ccRCC的药物。山奈酚(Kaempferol)又称为山柰酚、百蕊草素Ⅲ,是一种酚类化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗癫痫、抗凋亡、抗菌、止咳等多种药理活性[5,6,7]。研究表明，Kaempferol可以抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖，已经证实其具有抗癌作用[8]。Kaempferol可明显抑制肝癌细胞活性，可通过提高肝癌细胞自噬水平促进细胞凋亡[9]。这些研究均表明，Kaempferol具有抗肿瘤作用，但Kaempferol在ccRCC中发挥抗癌作用的研究并不多。研究发现，Kaempferol可以通过抑制蛋白激酶B(AKT)和黏着斑激酶(FAK)的磷酸化进而抑制786-O肾细胞癌侵袭和迁移[10];这表明Kaempferol在抑制肿瘤转移方面具有潜在价值，但其具体作用机制尚有争议。本研究旨在分析Kaempferol作用ccRCC细胞后，对细胞增殖、迁移和侵袭等影响，并初步探讨其调控ccRCC可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验材料

ACHN和769-P细胞购自中国科学典型培养保藏委员会细胞库；Kaempferol标准品(货号：CFN98838;纯度：98%)购自上海一基实业有限公司；5周龄SPF级BALB/C-nu裸鼠18只，雌雄各半，体质量18～20 g, 购自四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，许可证号：SCXK(川)2018-15;在南华大学SPF标准环境中饲养，并自由采食饮水，许可证号：SYXK(湘)2020-0002。

1.2 主要试剂与仪器

噻唑蓝(MTT)购自上海恒斐生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；低速离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；多功能酶标仪购自郑州中道生物技术有限公司；倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司；DMEM 高糖培养基购自成都贝兰米锦生物科技有限公司；胎牛血清购自BI公司；B细胞淋巴瘤2相关蛋白(Bcl2)A1一抗(货号：PAB13212)购自Abcam 公司；β-肌动蛋白(actin)一抗(货号：WE0354)购自万类生物科技有限公司；兔抗人上皮细胞E-钙黏蛋白(cadherin, 货号：YT710-TIH)、N-cadherin(货号：yb01047)和波形蛋白(Vimentin, 货号：AF-0004)单克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司；二甲基亚砜(DMSO,货号：D103271)购自Amresco 公司。

1.3 生物信息学分析

利用TargetNet、Swiss target prediction在线数据预测Kaempferol的靶基因，二者取交集，即得该药物的可能靶点。利用GEO自带的GEO2R在线分析GSE66271 、GSE66270数据集中肾癌和癌旁的差异基因，以P<0.05,|log2差异倍数(FC)|≥1为筛选条件分别选择2个数据集中表达上调的基因。将数据集中表达上调的基因与Kaempferol作用的靶基因取交集，筛选出共同基因。下载公共数据库TCGA中TCGA_KIRC RNA表达矩阵和临床信息，分析BCL2A1表达水平与ccRCC恶性临床表型之间的关系。使用Kaplan-Meier数据库评价筛选出共同基因mRNA水平对ccRCC患者生存期的影响。

1.4 细胞转染

将ACHN、769-P细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养，并选用对数生长期生长细胞进行后续实验。实验将细胞分成Vector组、Control组、Kaempferol组、BCL2A1组和Kaempferol+BCL2A1组。根据Lipofectamine2000说明书进行转染。将装有BCL2A1慢病毒质粒或空载质粒转染至细胞。Vector组转染空载质粒，Control组正常培养，BCL2A1组转染BCL2A1质粒，Kaempferol组用Kaempferol处理细胞，Kaempferol+BCL2A1组转染BCL2A1并用Kaempferol处理细胞。转染 48 h后，将含病毒的培养基更换为DMEM完全培养基。72 h后，改用含2 mg/L嘌呤霉素的培养基筛选阳性细胞，隔天更换含嘌呤霉素的培养基，待细胞长满后转至大皿，继续用含嘌呤霉素的培养基将细胞培养至密度为90%以上时，收集细胞，以备后续实验。Western印迹检测BCL2A1蛋白水平评估转染效率。

1.5 MTT检测细胞活力

取对数生长期的ACHN和769-P细胞，胰酶消化制备细胞悬液，每孔接种3 000个细胞到96孔板中，实验分为5组：空白对照组和Kaempferol不同浓度组(40、80、120、160 μmol/L)。细胞贴壁后，ACHN细胞给予0、40、80、120、160 μmol/L浓度的Kaempferol, 769-P细胞给予0、50、100、150、200 μmol/L浓度的Kaempferol; 培养48 h后，将10 μl MTT溶液(5 g/L)加入每孔中，在37 ℃下培育4 h。随后，移除培养基，加入150 μl DMSO,在酶标仪492 nm波长处检测各组细胞的吸光度，计算Kaempferol对ACHN和769-P细胞的生长抑制率。

1.6 山奈酚处理后细胞增殖检测

取稳定过表达BCL2A1的ACHN和769-P细胞，胰蛋白酶消化离心重悬，同样每孔接种3 000个细胞于96孔板中，每组接种6孔，以120或150 μmol/L浓度的Kaempferol处理细胞。将细胞置于CO2培养箱进行培养，每孔加入10 μl体积的CCK-8溶液，避光环境中孵育2 h, 于0、1、2、3、4、5 h时使用酶标仪(λ=450 nm)检测细胞吸光度。实验重复3次取均值。

1.7 细胞克隆形成实验

收集对数生长期ACHN和769-P细胞，用120或150 μmol/L Kaempferol分别处理ACHN和769-P细胞。将两组细胞(5×102/孔)接种至6孔板中，并置于培养箱中培养(37 ℃,5%CO2)。每隔两天给细胞换液。培养15 d 后，甲醇固定细胞，结晶紫染色，多次洗涤后，进行拍照和统计分析。

1.8 山奈酚处理后细胞迁移、侵袭能力检测

迁移实验中Transwell小室不添加Matrigel 胶，侵袭实验中Transwell小室添加Matrigel 胶。用120或150 μmol/L Kaempferol处理ccRCC细胞并接种至Transwell小室上层，下层添加含10%胎牛血清的培养液，于37 ℃、5%CO2培养48 h。用棉签擦去上室面上的细胞，固定结晶紫染色，随机取5个视野于显微镜下拍照，计数。

1.9 山奈酚处理后裸鼠移植瘤体积和重量的检测

收集处于对数期的ccRCC细胞重悬，接种于裸鼠腋下。随机分成Control组和Kaempferol组，每组9只。Kaempferol组按照160 mg/kg剂量灌胃Kaempferol, 1次/d, 待成瘤后，每2 d测量瘤体大小，计算肿瘤体积。第14天后处死裸鼠手术获取瘤体，测量体积和质量。实验动物均遵循3R原则，经动物实验伦理审查通过(审批号2021-KY-184)。

1.10 免疫组化染色

处死经1.9中处理过的裸鼠后，手术取裸鼠肿瘤组织，石蜡切片脱蜡，柠檬酸钠缓冲液修复，滴加一抗37 ℃孵育1 h, 阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，PBS冲洗3次，每次3 min; 滴加二抗孵育30 min, PBS充分淋洗后3次，洗涤后避光二氨基联苯胺(DAB)显色液显色并以苏木素复染3 min。3 min在显微镜下观察，拍照。

1.11 山奈酚处理后裸鼠肿瘤组织中BCL2A1蛋白表达

处死经1.9中处理过的裸鼠后，手术取裸鼠肿瘤组织，匀浆后加入裂解液提取总蛋白，凝胶电泳后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入BCL2A1一抗(1∶2 000),4 ℃孵育过夜。次日Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗涤6 min, 重复3次，然后加入封闭液稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(1∶3 000),室温孵育60 min, TBST洗涤6 min, 重复3次，电化学发光(ECL)液进行显影。

1.12 不同浓度山奈酚对BCL2A1及上皮间质转化相关蛋白表达的影响

ACHN细胞给予0、40、80、120、160 μmol/L浓度的Kaempferol, 769-P细胞给予0、50、100、150、200 μmol/L浓度的Kaempferol; 培育24 h后，收集各组不同浓度Kaempferol处理的ACHN和769-P细胞，采用Western印迹检测目标蛋白表达。

1.13 不同时间对BCL2A1蛋白表达的影响

用120或150 μmol/L Kaempferol分别处理ACHN和769-P细胞，培育24 h后，收集各组处理后的ACHN和769-P细胞。采用Western印迹检测BCL2A1蛋白表达。

1.14 BCL2A1可逆转山奈酚对细胞增殖、迁移和侵袭作用

将ACHN、769-P细胞根据 Lipofectamine2000说明书将BCL2A1或空载质粒转染至细胞中，Control组正常培养，Kaempferol组用Kaempferol处理细胞，Kaempferol+BCL2A1组转染BCL2A1并用Kaempferol处理细胞。转染 48 h后，收集各组细胞，采用Western印迹检测BCL2A1蛋白水平。

1.15 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行t检验、非参数秩和检验及重复测量方差分析。Kaplan-Meier法计算差异表达基因与预后的关系。

2、结果

2.1 预测山奈酚的靶基因及其与ccRCC临床不良表型之间的关系

通过Swiss Target和TargetNet在线数据库预测共获得105个Kaempferol作用靶点；GSE66271数据集中鉴定出2 493个上调基因，GSE66270数据集鉴定出2 875个上调基因；三者取交集后共筛选出19个基因，且其中有9个基因与ccRCC远端转移有关，见图1。

图1 Kaempferol作用靶点预测  

BCL2A1、CDK2、RIPK2、CDK1共4个基因在GSE66271和GSE66270中差异表达，见表1。随后对这4个基因进行分期和淋巴结转移等分析，结果显示，BCL2A1表达水平与ccRCC的临床表型关系最为密切。因此选择BCL2A1作为研究对象。与癌旁组织(86.62±8.71)相比，ccRCC组织中BCL2A1 mRNA表达(113.57±11.40)明显上调(P<0.05),T2～4分期和T1分期BCL2A1 mRNA表达(94.36±9.54)、(92.38±9.32)显著高于癌旁组织(71.42±7.21,P<0.05)。StageⅡ～Ⅳ分级和StageⅠ分级Mrna BCL2A1 mRNA表达(92.77±9.31)、(91.85±9.24)显著高于癌旁组织(70.54±7.08,P<0.05)。与M0期(66.82±6.72)相比，M1期BCL2A1 mRNA表达(76.83±7.72)明显上调(P<0.05)。与N0期(102.33±10.43)相比，N1期BCL2A1 mRNA表达(142.56±14.35)明显上调(P<0.05)。与G1-2期(95.34±9.62)相比，G3-4期BCL2A1 mRNA表达(108.71±10.96)明显上调(P<0.05)。复发患者BCL2A1 mRNA表达明显高于非复发患者[(104.58±10.52) vs (89.96±9.04),P<0.05]。预后不良患者BCL2A1 mRNA表达明显高于非复发患者[(110.35±11.14) vs (96.74±9.73),P<0.05]。K-M曲线结果提示，BCL2A1高表达患者生存期[(75.56±5.63)个月]明显低于BCL2A1低表达患者[(91.47±6.08)个月，P<0.05]。

表1 BCL2A1、CDK2、RIPK2、CDK1基因在GSE66271和GSE66270中的差异表达

2.2 山奈酚体外抑制ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭并调节EMT相关蛋白

Kaempferol 0、40、80、120、160 μmol/L作用于ACHN细胞后，细胞活力分别为1.01±0.10、0.75±0.07、0.67±0.07、0.46±0.05、0.32±0.03;Kaempferol 0、50、100、150、200 μmol/L作用于769-P细胞后，细胞活力分别为1.02±0.10、0.81±0.08、0.69±0.07、0.41±0.04、0.31±0.03。不同浓度Kaempferol作用于细胞后，对细胞增殖具有明显抑制作用(P<0.05),且呈浓度依赖性。120 μmol/L浓度作用ACHN细胞的抑制率与150 μmol/L浓度作用769-P细胞的抑制率接近50%,因此分别选择120 μmol/L和150 μmol/L的浓度做功能实验。Kaempferol组细胞OD值、克隆细胞数、迁移细胞数量、侵袭细胞数明显少于Control组(均P<0.05)。Kaempferol组E-cadherin表达明显高于Control组，N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显低于Control组(P<0.05)。见图2、表2、表3、图3。

图2 Kaempferol体外抑制ACHN和769-P细胞增殖、迁移、侵袭(结晶紫染色)   

表2 两组ACHN和769-P细胞增殖实验(OD值,

表3 两组细胞克隆、迁移和侵袭细胞数及移植瘤体积、质量和Ki67表达量比较

图3 Western印迹检测上皮间质转化相关蛋白表达   

1,2:Control组、Kaempferol组

2.3 山奈酚体内抑制裸鼠移植瘤增殖

随着时间增加，两组移植瘤体积不断增大，但Kaempferol组增长速度明显小于Control组(P<0.05)。Kaempferol组移植瘤体积和重量明显小于Control组(P<0.05)。与Control组相比，Kaempferol组中Ki67相对表达量明显降低，BCL2A1蛋白表达明显下降(P<0.05)。见表3、图4、表4。

图4 Kaempferol作用裸鼠对移植瘤Ki67表达影响(DAB染色，×200)   

表4 Kaempferol体内抑制裸鼠移植瘤体积增殖

2.4 不同浓度山奈酚及时间对BCL2A1蛋白表达的影响

ACHN细胞中，与Control组(1.23±0.02)相比，Kaempferol(40,80,120,160 μmol/L)组BCL2A1蛋白表达(1.08±0.03、0.91±0.02、0.75±0.02、0.69±0.02)明显下降(P<0.05);769-P细胞中，与Control组(1.17±0.03)相比，Kaempferol(50,100,150,200 μmol/L)组BCL2A1蛋白表达(1.04±0.03、0.88±0.02、0.71±0.02、0.65±0.02)明显下降(P<0.05)。ACHN细胞中，与Control(1.32±0.04)相比，Kaempferol(12,24,48 h)组BCL2A1蛋白表达(1.15±0.04、1.01±0.03、0.88±0.02)明显下降(P<0.05);769-P细胞中，与Control组(1.25±0.05)相比，Kaempferol(12,24,48 h)组BCL2A1蛋白表达(1.10±0.04、0.96±0.03、0.82±0.03)明显下降(P<0.05)。见图5。

图5 Western印迹检测Kaempferol对BCL2A1蛋白表达的影响   

2.5 恢复BCL2A1表达，山奈酚抑制ccRCC细胞的作用被逆转

Western印迹结果显示，在ACHN和769-P细胞中，BCL2A1组BCL2A1蛋白表达(10.87±0.04、0.89±0.05)明显高于Vector组(0.49±0.02、0.52±0.03,P<0.05)。与Control组相比，Kaempferol组E-cadherin蛋白表达明显增加，BCL2A1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显减少；Kaempferol+BCL2A1组E-cadherin蛋白表达明显低于Kaempferol组，BCL2A1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显高于Kaempferol组(P<0.05)。细胞增殖实验结果显示，Kaempferol 组细胞活力明显低于Control组；Kaempferol+BCL2A1组细胞活力明显高于Kaempferol 组(P<0.05)。细胞克隆实验结果显示，Kaempferol 组克隆细胞数量明显少于Control组；而Kaempferol+BCL2A1组克隆细胞数量明显多于Kaempferol 组(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示，Kaempferol 组迁移细胞数明显少于Control组；Kaempferol+BCL2A1组迁移细胞数明显多于Kaempferol 组(P<0.05)。细胞侵袭实验结果显示，Kaempferol 组侵袭细胞数明显少于Control组；Kaempferol+BCL2A1组侵袭细胞数明显多于Kaempferol 组(P<0.05)。见表5、图6～9、表6、表7。

表5 Western印迹检测3组BCL2A1及EMT相关蛋白表达

图6 Western印迹检测各组BCL2A1蛋白表达   

图7 Western印迹检测3组BCL2A1及EMT相关蛋白表达   

图8 恢复BCL2A1表达后Kaempferol抑制ccRCC细胞增殖能力(结晶紫染色)  

图9 恢复BCL2A1表达后Kaempferol抑制ccRCC细胞迁移及侵袭能力(结晶紫染色，×200)

表6 恢复BCL2A1表达后Kaempferol抑制抑制ccRCC细胞增殖作用被逆转(OD值,

表7 恢复BCL2A1表达后Kaempferol抑制抑制ccRCC细胞克隆、迁移和侵袭作用被逆转

3、讨论

ccRCC是发病于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，在泌尿生殖系统恶性肿瘤中占第二位，多数患者在确诊时已经是晚期ccRCC或发生病灶[10,11]。随着现代人生活饮食方式的改变，ccRCC的发病率呈上升趋势，也越来越低龄化[12,13]。但ccRCC发病的分子基因尚无统一定论。目前，由于ccRCC缺乏早期的诊断标志，晚期性和转移性ccRCC对常规的放化疗治疗方式不敏感，即使采用手术根除，患者也容易出现复发，且多数患者预后不良[14,15,16,17]。因此，寻找作为ccRCC预防、诊断及治疗的生物标志物，对靶向治疗患者并提高生存率及生活质量十分有意义[18]。

Kaempferol是常见的黄酮类化合物，长期膳食能降低致癌的风险[19]。目前，已有许多研究表明Kaempferol在肺癌、乳腺癌、宫颈癌及胶质母细胞瘤扥多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用[20,21]。既往研究显示，Kaempferol诱导三阴性乳腺癌细胞中孕烷X受体蛋白表达下调进而抑制细胞生长[22]。Kaempferol可以通过调控miR-21表达进而抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖能力[23]。这些研究均显示，Kaempferol对肿瘤细胞增殖具有很好的抑制作用。本研究结果表明，Kaempferol能抑制肾透明癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，是良好的抗肿瘤药物。

此外，本文动物实验确定Kaempferol在体内发挥抑制作用。既往研究表明，Kaempferol 可体外抑制乳腺癌 细胞增殖并促进细胞凋亡[24]。Ki67是临床应用作为广泛的增殖细胞标志物，通常用于评估判断肿瘤的良恶性及恶性程度[25]。陈梅林等[26]研究表明，Ki67可以联合维生素D预测三阴性乳腺癌患者的预后。该研究结果进一步证实Kaempferol对ccRCC增殖的抑制作用。Kaempferol作用裸鼠后可能会对肾脏组织产生一定的毒副作用，进而影响肾脏组织形态学变化，但本研究主要是在细胞水平分析Kaempferol对ccRCC生物学行为的影响，对于Kaempferol作用裸鼠后的毒理反应未深入分析，这也是本文的局限性，需要分析研究。

BCL2A1基因是BCL2蛋白家族中的抗凋亡因子，构成了调节线粒体或内在的细胞凋亡反应信号网络[27]。BCL2A1基因被鉴定为控制自身免疫和炎症疾病的潜在靶标，同时也是抗癌疗法的靶基因[28,29]。BCL2A1的半衰期很短，因为它是由泛素-蛋白酶体系统组成的，这构成了调节BCL2A1功能的主要肿瘤抑制机制[30]。研究表明，长链非编码(Lnc)RNA激素抵抗相关非编码序列(HORAS)5可以诱导BCL2A1表达，减少前列腺癌细胞凋亡增加耐药[31]。本研究结果提示，Kaempferol作用ccRCC细胞可调节BCL2A1表达水平，抑制细胞增殖、迁移、侵袭能力。

N-cadherin是一种细胞表面黏附蛋白，促进和保护细胞黏附，在细胞增殖、迁移和侵袭中发挥作用。E-cadherin是在上皮细胞膜表达的跨膜糖蛋白，能够介导上皮细胞间的黏附连接，对维持正常上皮细胞形态和结构完整具有重要作用。本研究结果提示，Kaempferol可以通过靶向调控BCL2A1表达进而调节E-cadherin/Vimentin/N-cadherin蛋白表达，抑制ccRCC细胞上皮细胞发生上皮间质转化，抑制肿瘤的侵袭和迁移。

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基金资助:湖南省2019自然科学基金(2019JJ50550);湖南省卫健委课题(B202304056903);

文章来源:陈选才,符浩,唐亚纯等.山奈酚靶向B细胞淋巴瘤2相关蛋白A1抑制肾透明细胞癌细胞生物行为[J].中国老年学杂志,2024,44(06):1397-1405.