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溶瘤病毒诱导肿瘤凋亡及激活抗肿瘤免疫机制的研究进展

2021-10-27 158 上传者：管理员

摘要：恶性肿瘤被认为是细胞不受控制的生长和增殖。肿瘤细胞为避免被清除，形成多种自我保护机制，其中包括对细胞凋亡的抵抗，以及通过影响免疫系统形成的免疫逃逸。这使得肿瘤细胞具有很强的增殖能力，并产生高度的侵袭、转移倾向。部分肿瘤患者，在接受治疗时，效果并不理想或在治疗后，仍然出现复发、转移的情况。因此，新的治疗方式的研发是当务之急。溶瘤病毒的发现为恶性肿瘤的治疗提供了新思路。随着对溶瘤病毒的深入研究，人们发现溶瘤病毒可以通过多种机制发挥抗肿瘤作用，除了在肿瘤细胞中复制、引起肿瘤细胞的裂解，还能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。此外，溶瘤病毒通过激活免疫细胞从而，启动抗肿瘤免疫应答并改变肿瘤细胞周围的免疫微环境来发挥长效的抗肿瘤作用，并抑制未感染病毒的肿瘤细胞。溶瘤病毒能够同时针对细胞凋亡以及机体抗肿瘤免疫发挥作用使其可以有效地对抗肿瘤细胞的凋亡抵抗和免疫逃避，使得它作为潜在的抗肿瘤治疗方式受到广泛关注。本文旨在介绍溶瘤病毒通过诱导肿瘤细胞凋亡以及激活免疫系统进而发挥抗肿瘤作用的相关研究进展。

关键词：
免疫检查点
免疫逃逸
恶性肿瘤
溶瘤病毒
细胞凋亡
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恶性肿瘤已经成为威胁人类健康和生命的第二大疾病，每年患病人数以及死亡人数均呈现上升的趋势[1]。目前为止，对于恶性肿瘤的治疗，临床中以外科手术切除、化疗药物治疗以及放射治疗为主，部分早期患者可以在治疗中获得较大的收益。但由于恶性肿瘤细胞形成的多种自我保护机制如凋亡抵抗和免疫逃逸，使得恶性肿瘤的治疗不易取得理想的效果。因此，找到新的、有效的治疗手段是十分必要的。溶瘤病毒正是其中一种。溶瘤病毒是自然界中原本存在或通过基因工程人为改造的病毒，能够选择性感染并杀伤恶性肿瘤细胞，但对正常细胞几乎不会产生副作用。常见的溶瘤病毒载体可以根据其核酸的类型，分为双链DNA病毒(腺病毒，单纯疱疹病毒)、双链RNA病毒(呼肠孤病毒)、正链RNA病毒例(如萨奇病毒)以及包括麻疹病毒在内的负链RNA病毒[2]。随着对溶瘤病毒抗肿瘤机制的深入研究，人们发现溶瘤病毒能够通过多种机制杀伤肿瘤细胞，包括在肿瘤细胞内复制后直接裂解肿瘤细胞，激活凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞发生自噬，以及激活免疫细胞的成熟并促进免疫细胞内细胞因子的分泌，来触发抗肿瘤免疫应答[3,4]。本篇综述重点介绍溶瘤病毒如何通过诱导凋亡及激活免疫发挥抗肿瘤作用。

1、溶瘤病毒通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用

1.1 肿瘤细胞的凋亡抵抗

细胞凋亡是多细胞有机体为维持内稳态在基因层面进行控制的细胞主动性死亡，而肿瘤细胞可以通过不同策略对抗凋亡[5]。例如通过诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的表达[6],或通过突变和沉默凋亡相关基因p53,抑制促凋亡蛋白影响该基因所诱导的凋亡途径[5],恶性肿瘤细胞中凋亡相关蛋白及受体，如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)和肿瘤坏死因子相关诱导配体(TRAIL)的受体的缺失[7],同样会导致凋亡抵抗。这种对凋亡的抵抗能力，增加了恶性肿瘤的治疗难度，而溶瘤病毒对肿瘤细胞凋亡的诱导能力，使其能够对抗恶性肿瘤的凋亡抵抗。

1.2 溶瘤病毒通过线粒体通路诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡主要通过内在途径(线粒体通路)、外在途径(死亡受体通路)以及内质网通路激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase),从而导致细胞凋亡的发生。研究发现十二指肠腺癌细胞被溶瘤病毒中的新城疫病毒感染后，细胞浆中的细胞色素C(CytC)水平明显增高，且Caspase-9在感染早期被激活，这表明新城疫病毒能够感染肿瘤细胞并通过诱导肿瘤细胞的凋亡发挥抗肿瘤作用[8]。CytC能够与细胞凋亡酶激活因子(Apaf1)和Caspase-9前体共同结合形成凋亡复合体。凋亡复合体能够激活Caspase-9,而活化的Caspase-9进一步诱导Caspase-3引起细胞凋亡的发生，这一过程是细胞凋亡的内在途径即线粒体通路[9]。在乳腺癌中，新城疫病毒能够使感染的乳腺癌细胞的Caspase-3和Caspase-9的基因表达水平明显上调，这一结果进一步证实诱导肿瘤细胞凋亡的线粒体途径是该溶瘤病毒杀死肿瘤细胞的机制之一[7]。而另一种E1B55-kDa基因缺失的溶瘤腺病毒被植入了热休克蛋白辅助因子ST13基因后，被观察到能够引起结肠癌细胞中抗凋亡基因Bcl-2的下调，并释放CytC,进而启动Caspase-9和Caspase-3介导的线粒体凋亡通路，抑制肿瘤细胞的凋亡抵抗[8]。

1.3 溶瘤病毒通过死亡受体通路诱导肿瘤细胞凋亡

溶瘤病毒除了通过线粒体途径，还能够通过死亡受体介导的外部途径诱导凋亡，这一途径也被称为死亡受体通路。是通过细胞外的死亡配体与死亡受体结合，将细胞外的信号传导到细胞内诱导凋亡。死亡受体是肿瘤坏死因子超家族的成员，死亡配体包括肿瘤坏死因子(TNF)、凋亡相关因子配体(FasL)和肿瘤坏死因子相关诱导配体(TRAIL),当死亡配体与各自的死亡受体结合后能够，使胞内的死亡受体招募包含死亡域(DD)的衔接分子蛋白，并吸引Caspase-8前体，结合形成死亡诱导信号复合体(DISC),然后激活Caspase-8。活化的Caspase-8使Caspase-3等效应Caspase启动[9,12]。目前，已经在多个感染了新城疫病毒的肿瘤细胞系中，发现了Caspase-8蛋白的升高，同时还发现，死亡受体介导的凋亡可能发生在线粒体途径之后[5]。此外，溶瘤痘苗病毒既可以通过线粒体通路也可以通过死亡受体通路诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用[13,14]。

近些年，随着基因工程的不断发展，通过改造野生型溶瘤病毒来增强其对肿瘤细胞的选择性或使溶瘤病毒携带编码抗肿瘤相关因子的基因成为了主要研究方向[15,16]。这种方式也被应用于增强溶瘤病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过将携带了TRAIL基因的重组溶瘤腺病毒感染三阴性乳腺癌细胞，研究者发现，感染病毒的肿瘤细胞中TRAIL的表达升高，并且细胞凋亡明显增加[17]。此外，通过将TRAIL基因植入痘苗病毒，构建的重组溶瘤痘苗病毒，同样能够在宿主细胞中表达TRAIL蛋白，当分别将重组病毒和未植入TRAIL基因的痘苗病毒感染肺癌细胞后，检测凋亡细胞的数量，发现，这种方式靶向增强了重组病毒诱导细胞凋亡的能力[18]。这些结果表明溶瘤病毒能够通过死亡受体通路诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。

1.4 溶瘤病毒通过内质网通路诱导肿瘤细胞凋亡

内质网通路是独立于线粒体途径和死亡受体途径的又一诱导凋亡的主要途径。内质网应激后，蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)的激活可以促进真核起始因子2α(eIF-2α)的磷酸化，而磷酸化的eIF-2α可以活化激活转录因子-4(ATF4)来激活C/EBP同源蛋白(CHOP)促使细胞发生凋亡[19,20]。溶瘤病毒能够通过内质网通路诱导肿瘤细胞凋亡同样得到证实。新城疫病毒在感染肿瘤细胞后便会刺激eIF-2α激酶PERK的活化以及eIF-2α的磷酸化，并激活Caspase-12和Caspase-3来诱导肿瘤细胞的凋亡[21]。内质网应激还会引起位于内质网膜中的Caspase-12的表达，被激活的Caspase-12可以不用通过线粒体通路而直接触发Caspase-9的活化[22],最终激活Caspase-3。Jia等[23]的研究中发现痘苗病毒感染肝癌细胞后，Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12被激活的同时CHOP的表达明显上调，一些抗凋亡蛋白表达减少，说明痘苗病毒同样可以通过激活内质网通路来诱导肿瘤细胞的凋亡。

2、溶瘤病毒通过影响免疫系统发挥抗肿瘤作用

2.1 肿瘤细胞的免疫逃逸机制

肿瘤细胞能够在体内增殖转移的一个主要原因是它能够逃脱免疫系统的监视，称为免疫逃逸。低突变负荷的肿瘤细胞倾向于产生较少的新抗原，使得他们更不容易被识别为外来抗原，形成低免疫原性[24]。即使肿瘤细胞表达了足够的免疫原性抗原，但由于免疫识别依赖于主要组织相容性复合体(MHC)暴露抗原的能力，而肿瘤细胞MHC表达减少或抗原提呈的缺陷，使肿瘤细胞得以避免被肿瘤特异性T细胞清除[25]。此外，肿瘤细胞还可以通过在体内释放转化生长因子-β、白介素-10和趋化因子等免疫抑制分子来构建一个免疫抑制的微环境，保护肿瘤细胞[26]。近几年发现，免疫检查点受体与配体的结合，能够抑制T细胞功能，是免疫逃逸的又一重要机制。肿瘤细胞会通过提高抑制性免疫检查点的表达，通过与T细胞表面的免疫检查点受体结合，抑制T细胞的抗肿瘤能力，来躲避免疫系统的监视。而溶瘤病毒，可以招募并活化免疫相关细胞如中性粒细胞或肿瘤特异性T细胞等，从而激活抗肿瘤免疫应答，同时还能影响免疫检查点的表达，来对抗肿瘤细胞的免疫逃逸，从而发挥抗肿瘤作用。

2.2 溶瘤病毒激活抗肿瘤免疫反应

溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，会激活抗肿瘤免疫应答，一方面可以发挥长期的抗肿瘤作用，另一方面，被激活的免疫系统，除了能够杀伤被病毒感染的肿瘤细胞，还会识别并清除远处未被感染的肿瘤细胞。用痘苗病毒在治疗胰腺癌小鼠模型后，肿瘤细胞周围浸润的CD8+T细胞和CD4+T细胞数量也出现增加。在体外实验中，研究者观察到，痘苗病毒可以增强树突状细胞(DCs)和巨噬细胞的活性，并诱导巨噬细胞朝着负责提呈抗原、发挥免疫监视作用的具有抗肿瘤能力的M1型极化，表明痘苗病毒可以通过增强抗肿瘤免疫反应来杀伤肿瘤细胞[27]。当溶瘤病毒裂解肿瘤细胞后，裂解的细胞会释放出病原相关分子模式(PAMPs)、损伤相关分子模式(DAMPs)以及肿瘤相关抗原(TAAs),这些物质在溶瘤病毒启动抗肿瘤免疫的过程中都起到了关键作用。PAMPs包括病毒衣壳、病毒遗传物质和病毒复制过程中的代谢产物，可以由DCs表面表达的模式识别受体(PRR)如toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)识别[28],PAMPs与PRR的结合会刺激DCs产生TNF-α、白介素-12等细胞因子[29]。

这些细胞因子一方面可以招募并启动更多的自然杀伤细胞(NK)或DCs,另一方面还可以促进DCs的成熟，使其进一步分泌细胞因子。DAMPs包括ATP、钙网蛋白(CRT)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1),由死亡、应激或损伤的细胞分泌[30]。ATP相当于一个“找到我”的信号可以招募DCs,CRT则相当于一个“吃掉我”的信号，可以促进细胞的吞噬，HMGB1则可以直接激活DCs[31]。被激活的成熟DCs会识别TAAs将其提呈并暴露给CD8+T细胞[32],CD8+T细胞的抗肿瘤活性可以通过直接释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒来实现，也可以通过分泌TNF-α和白介素-2等细胞因子间接实现[33,34]。重组痘病毒CF33-hNIS-ΔF14.5也可以在乳腺癌小鼠模型中进行免疫调节，来促进肿瘤细胞周围CD8+T细胞和CD4+T细胞的浸润[35]。溶瘤病毒因此成为抗肿瘤免疫治疗中极具潜力的治疗方式。

2.3 溶瘤病毒增强免疫检查点的抗肿瘤能力

免疫检查点是一组位于细胞表面、能够调节免疫的分子，可以促进或抑制免疫细胞的功能。免疫检查点受体中的程序性死亡受体1(PD-1)位于活化的CD8+T细胞表面。正常情况下，CD8+T细胞(也称为细胞毒性T细胞，CTLs)通过抗原提呈细胞(APC)提呈的抗原识别并杀伤肿瘤细胞，而肿瘤细胞和肿瘤微环境中的其他细胞会上调免疫检查点配体PD-L1的表达[36]。PD-1与PD-L1结合，会抑制T细胞的迁移、增殖和分泌，并诱导T细胞凋亡和功能衰竭，从而阻断肿瘤免疫循环[37,38]。PD-1/PD-L1抑制剂正是针对这一机制发挥作用，通过竞争性结合PD-1受体和PD-L1配体，阻止PD-1与PD-L1的结合，促进免疫监视，抑制肿瘤细胞的发生发展。但由于许多恶性肿瘤细胞中PD-L1表达水平较低，同时肿瘤微环境中的浸润性淋巴细胞较少，是所谓的“冷肿瘤”[39],免疫检查点抑制剂对这类肿瘤的治疗效果非常有限。

免疫检查点抑制剂对“热肿瘤”的治疗效果相比于“冷肿瘤”更为显著[36,40],而溶瘤病毒对免疫细胞的激活恰好可以将“冷肿瘤”加热成为“热肿瘤”[41,42]。在Mostafa等[43]的研究中，发现呼肠弧病毒能够诱导PD-L1在人和小鼠乳腺癌细胞中表达，从而提高免疫检查点抑制剂的效果。溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂的协同抗肿瘤作用存在于多种溶瘤病毒中[44],包括单纯疱疹病毒[45]和腺病毒[46]等。此外，通过溶瘤病毒携带并表达目的基因，能够改变肿瘤免疫微环境和免疫检查点的表达。白介素-12能够启动固有免疫和适应性免疫，而白介素-7可以协同白介素-12刺激T细胞的活化。利用能够编码白介素-7和白介素-12的溶瘤痘苗病毒，能够增加肿瘤浸润淋巴细胞，改变免疫微环境，增强溶瘤病毒激活抗肿瘤免疫的能力，同时上调PD-L1的表达，使得肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性的增加[47]。溶瘤病毒对免疫检查点的影响，使得溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂的联合治疗可能会成为未来临床应用的主要方式。

3、小结与展望

溶瘤病毒由于具备对肿瘤细胞的选择性感染和直接杀伤作用，以及诱导肿瘤细胞凋亡和激活抗肿瘤免疫的激活能力，成为肿瘤免疫治疗的热门研究方向。目前，已经有溶瘤病毒药物被批准应用于临床，Oncorine(H101)是中国食品药品监督管理局于2005年批准用于治疗头颈部肿瘤的重组溶瘤腺病毒[48],美国食品和药物管理局在2015年批准一种溶瘤单纯疱疹病毒-Talimogenelaherparepvec(T-VEC)应用于治疗皮肤和淋巴结的黑色素瘤[49],这也充分证实了溶瘤病毒作为治疗恶性肿瘤药物的临床可行性。溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂联合应用取得的效果，也使得溶瘤病毒相关的联合治疗成为了更具前景的方式，因此溶瘤病毒除了联合免疫检查点抑制剂，联合放疗、化疗，甚至两种以上治疗方式的联合应用都是未来研究的方向。但溶瘤病毒作为一种新的辅助治疗方式，它的机会窗暂时还不明确。术前应用溶瘤病毒确实能够提供一个长期的抗肿瘤免疫来预防复发和限制转移[50],但是术前应用是否优于术后应用仍需要进一步验证。总之，溶瘤病毒为恶性肿瘤治疗建立了一个新的平台，成为了肿瘤治疗过程中对抗肿瘤细胞凋亡抵抗和免疫逃逸的新治疗方式。

文章来源：金升烨,庞达.溶瘤病毒诱导肿瘤凋亡及激活抗肿瘤免疫机制的研究进展[J].实用肿瘤学杂志,2021,35(05):462-467.