癌症是全球主要的公共卫生问题，2014-2018年期间，癌症死亡占中国 所有死因的24%[1]。2020年全球有近 2 000万新发恶性肿瘤病例，死于恶性肿瘤的患者近1 000万，在目前100 多个国家中恶性肿瘤是人口的第一或第二大死因，全球恶性肿瘤医疗负担在持续增长。三级淋巴结构(tertiary lymphoid structure, TLS)是由于慢性炎症或者癌症刺激在肿瘤免疫微环境等非淋巴组织中产生的淋巴细胞簇[2]。近年来对于TLS的研究逐渐增多，在多个临床试验中被认为具有预测免疫治疗反应的潜在作用，甚至有学者认为在未经治疗的患者中，TLS密度是最强的独立预后标志物[3]。

TLS在癌症、感染、自身免疫性疾病、慢性炎症疾病和衰老等疾病中的临床相关性取决于实际情况。即使在同一器官中，TLS可以是有益的，也可以是有害的，这取决于它们的组成成分以及疾病的病因和时期。TLS的存在与癌症和感染的有利预后相关，然而在自身免疫性疾病和慢性与年龄相关的炎症疾病(包括慢性肾脏疾病)中，TLS的存在与更严重的疾病进展有关[4]。目前，TLS的研究主要集中在恶性实体瘤如：皮肤鳞状细胞癌[5]、喉鳞状细胞癌[6]、口腔鳞状细胞癌[7]、结直肠癌[8]和乳腺癌[9]等。鉴于这些研究，诱导肿瘤相关TLS形成已被提出作为一种免疫治疗方法[10]。虽然TLS在人体不同组织中的发生具体分子机制尚不清楚，可能受到炎症刺激或器官特异性环境的影响[11],但鉴于TLS在一些癌症上不仅可以评估患者的预后，而且还能有着良好预后的预测作用，因此我们希望通过对其更加清晰的了解来探索癌症新的免疫治疗方法。本文将对TLS结构组成、分类标准、临床预后及免疫治疗中的价值相关研究进行综述。

1、TLS的结构组成和形成机制

1.1 TLS的结构组成

TLSs与次级淋巴器官(secondary lymphoid organs, SLOs)在解剖和功能上相似，典型的TLS由含有活跃生发中心的B细胞区和周围含有各种类型树突状细胞(dendritic cell, DC)、T细胞和高内皮小静脉(high endothelial venules, HEV)的T细胞区组成[5]。但大多数TLSs结构无纤维包膜，这样其内部的免疫细胞可以与周围组织直接接触，并更高效识别提呈抗原产生适应性免疫性，也正是由于这种特殊结构导致的产生免疫抑制的微环境使得TLSs的功能变得复杂多样[12,13,14]。在不同的癌症类型比如乳腺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中也发现了TLS成分的差异[12],例如，DC-LAMP+DCs在NSCLC的TLS结构中被描述，但在其他癌症类型中较少[15,16]。

1.2 TLS的形成机制

有研究表明TLS的形成初始环节依赖于SLOs和HEV[12,13]。在肿瘤微环境的因子刺激下，SLOs中的一些淋巴细胞经血管或淋巴管进入肿瘤组织，随后肿瘤浸润的淋巴细胞与基质细胞作用可诱导各种趋化细胞因子的生成，如CXC趋化因子配体13(CXC-chemokine ligand 13,CXCL13)。CXCL13是20多年前发现的，对B细胞迁移到生发中心起关键作用，其主要功能是控制淋巴滤泡内B细胞的募集和组织。CXCL13可选择性地与趋化因子受体CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5,即CD185)结合，CXCR5-CXCL13相互作用控制着B细胞在形成滤泡中的定位和结构组织[17]。

定义TLS的标记物常取决于研究者的偏好和TLS的组成。因此也有人采用HEV的特异性标志物外周淋巴结寻址蛋白(peripheral node addressins, PNAd)作为TLS中的核心标志物[7]。HEVs被定义为介导淋巴细胞向淋巴结(lymph node, LN)和其他继发性淋巴器官转移的特殊血管[18],其具有介导L-选择素表达淋巴细胞招募的独特能力，对TLSs的形成以及从血液中将初始B细胞和T细胞募集到淋巴组织至关重要，这可能有助于消除肿瘤[12,19]。

TLS可以在血管化的器官中出现，这是因为血管周围的血小板衍生生长因子受体阳性(PDGFRβ+)间质细胞是滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells, FDC)的前体细胞，它以淋巴毒素β特异性受体(lymphotoxin β receptor, LTβR)依赖的方式协助B细胞的聚集和TLS的发展[20]。肿瘤相关TLS提供必要的特殊血管和化学物质从而让T细胞浸润[21],并与肿瘤浸润的T细胞和浆细胞显著相关[22]。B细胞和T细胞受体的测序数据表明肿瘤相关TLS中淋巴细胞的克隆性增殖，提示在启动抗肿瘤免疫中TLS起直接作用[23,24]。为了使肿瘤相关血管正常化，有研究将由激活的T细胞产生的一种诱导性炎症细胞因子LIGHT(tumor necrosis factor superfamily member 14,TNFS14即CD258)传送至这些血管，导致RIP1-Tag5小鼠自发产生的胰腺神经内分泌肿瘤对抗癌疫苗和免疫检查点抑制剂治疗敏感。而靶向肿瘤相关血管的LIGHT诱导了TLS的形成，这可以解释为LIGHT是SLOs和TLS发育所必需的配体[25]。当然，目前对于TLS形成过程的大部分理解都是依赖于慢性感染和自身免疫性疾病模型中发现的，因而这些发现仅应成为癌症中TLS形成的一种假设原因。

1.3 TLS的成熟度分级和评估方法

在炎症或肿瘤中，TLS可以以不同的成熟状态存在，从淋巴细胞的细胞聚集体(主要是B细胞)到具有生发中心的功能性成熟滤泡(图1)。TLS 显示的整体结构组织与在 SLOs中观察到的非常相似，一个主要的区别在于TLS中没有自然杀伤(natural killer, NK)细胞的存在[26]。

图1 组织中的TLS组成以及分级   

生发中心(germinal center, GC)是一个动态的结构，形成于次级淋巴器官B细胞滤泡的中心，分布在滤泡树突状细胞(FDC)的基质细胞网络中。成熟GC的一个重要特征是它分为两个部分即暗区(dark zone, DZ)和光区(light zone, LZ)。DZ和LZ中GC的B细胞分别被称为中心母细胞和中心细胞，中心母细胞和中心细胞应被视为同一发育步骤中不同的状态[27]。以中心母细胞为主并且缺乏FDC的最接近淋巴结和脾脏中的T细胞区，被称为DZ。富含FDC和中心细胞的最靠近LN中的被膜或脾脏中的边缘区，被称为LZ[28]。GC内的B细胞高度增殖，这是产生具有广泛亲和力的突变克隆用于免疫抗原的先决条件，这将表达高度选择的抗体库并激活补体途径，触发抗体依赖的细胞毒性和细胞杀伤来发挥抗肿瘤作用[29]。

目前对于TLS尚没有一个统一的分类标准，但已有诸多研究将其依据各自的理解进行分类，比如按照TLS的密度、TLS的成熟度标记物、GC的存在与否等等。有学者认为成熟的TLS中CD20+B细胞聚集到卵泡结构而无论TLS的密度[5],有人认为成熟的TLS是具有GC的淋巴细胞簇[29],也有研究发现L1CAM表达从未在没有成熟TLS形态的淋巴聚集体中发现[30]。目前多数研究均采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, H&E)和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术来定义TLS的成熟与否，各种标记物均有各自的优势，这让我们更加迫切寻求能够被广泛认可的能作为金标准的标记物。利用对TLS成熟度的分析，下一步可以探究TLS成熟度是否影响预后以及对预后的影响程度。

2、TLS对预后的影响

众所周知，肿瘤患者临床预后与临床分期、病理分级、肿瘤恶性程度等众多因素密切相关，但现有的预测患者预后TNM分期指标仅考虑肿瘤本身的恶性生物学行为，缺乏对肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的考虑。随着人们对TME的认识逐渐加深，发现TME中淋巴细胞的浸润程度可以反应肿瘤患者的临床预后与疾病的转归。因此大量的研究探讨了TME中TLS的数量、位置、成熟程度、细胞成分等因素与临床预后的关系。例如人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)阳性的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)患者的预后比HPV阴性的HNSCC患者更好，因为他们对化疗和放疗的反应更少，而后者多数因长期酗酒和吸烟而受到生理损害[31],而在HNSCC中TLS与HPV的关系也很显著，无论HPV阳性或是阴性，B细胞主要浸润TLS,并且无论组织部位是扁桃体还是舌，HPV状态都决定了TLS的形成与否[32]。

诸多研究表明，TLS的存在通常与良好预后相关，TLS可以促进免疫细胞的合作，并为B细胞提供一个特殊的微环境，进一步诱导TLS中CD4+T细胞的活化和肿瘤区域CD8+T细胞的有效募集，以产生和维持有效的抗肿瘤体液和细胞免疫从而改善预后。部分研究发现只有成熟TLS才提示良好的预后，比如在胰腺癌[33]、肺鳞癌[3]、结直肠癌中[34],但是成熟TLS的密度以及成熟TLS占总TLS的比例却不影响食管鳞癌的预后[35]。

TLS的存在并不意味着对预后绝对的改善，仍有许多因素在其中发挥影响。TLS对肿瘤的影响是特异性的，比如TLS的成熟度和分布对透明细胞肾癌和膀胱癌的预后存在显著差异[36]。研究发现，化疗中的皮质类固醇治疗对TLS的发育不利导致其不能改善预后，因而其宣称TLS密度是未经治疗患者中最强的独立预后标志物[3]。与此同时，成熟TLS的食管鳞癌患者生存率明显高于未成熟或阴性TLS患者，TLS的密度和成熟TLS占总TLS的比例却与食管鳞癌患者的总体生存期(overall survival, OS)、 无病生存期(disease-free interval, DFS)无关。由此可见，TLS对于不同癌症的预后需要具体分析，但其在多数实体瘤中目前是认为对预后有利的。TLS在人类癌症中的特征具体见 表1[3,5,6,7,29,30,37,38,39,40,41,42,43,44]。

表1 TLS在人类癌症中的特征

综上所述，TLS作为TME中抗肿瘤免疫应答产生与维持的主要结构单位，在患者的治疗预后评估中有着重要的意义，对于TME中免疫特性的评价主要基于杀伤性肿瘤浸润T细胞的“免疫评分体系”,而基于TLS中B细胞的浸润特性缺乏考虑，在未来工作中，若将TLS的检测与“免疫评分体系”联合用于肿瘤患者预后的预测，可以精准地筛选出高复发、高转移、高风险的患者，预测出可从免疫治疗获益的人群，实现精准肿瘤学的目的。值得注意的是，目前很多研究均是回顾性研究，期待国内外有更多的机构开展关于TLS前瞻性研究。

3、TLS与免疫治疗

过去经典的观点认为，肿瘤特异性免疫反应的产生需要树突状细胞从原发肿瘤迁移到淋巴结，其中初始CD4+ T细胞在肿瘤抗原提呈后启动和激活。然而一些研究表明，在原发肿瘤中，抗原提呈到T细胞的过程也可能发生在TLS内[45],绕过抗原提呈细胞和淋巴细胞在肿瘤组织与SLOs之间的往返过程，从而高效快速地产生抗肿瘤免疫反应。这一发现引起人们对研究TLS对免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICI)治疗反应的强烈兴趣。

在肿瘤免疫治疗时代，利用抗肿瘤免疫效应对肿瘤生长控制可以通过免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade, ICB)实现[46],这与传统的化疗放疗机制不同，免疫治疗依靠的是人体自身的免疫系统，因而TLS作为肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)的独特结构越来越受到关注。TIME是由不同类型免疫群体组成的复杂网络，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，同时也对预后和治疗效果产生重要影响。TLS分布在瘤内或者瘤周，导致淋巴细胞和肿瘤细胞有更高的相遇概率，因而这些局部淋巴结构可能导致更强的免疫效应。

经TLS与ICI的疗效之间关联的分析，TLS可预测ICI的治疗效果，而ICI的疗效也可以反过来推测TLS的状态和密度。有研究表明ICI疗效更好的患者肿瘤组织中的TLS分布密度更高[47],而这也意味着T细胞与B细胞之间的相互作用是有利于产生抗肿瘤免疫的。鉴于TLS对癌症预后的有利影响，诱导TLS形成是一个富有潜力的治疗方向。通过组织特异性表达TLS相关细胞因子和趋化因子，包括淋巴毒素[48]、TNFa[49]、LIGHT[50]、CXCL13[51]、CCL19、CCL21和CXCL12[52],诱导局部TLS的可行性已在小鼠模型中得到证实，这为以后进行临床验证提供了一定的基础。大多数TLS通常位于肿瘤间质和瘤周组织，比如黑色素瘤[53]、非小细胞肺癌[54]、肝细胞癌[40]、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)[5]等，研究发现TLS在CSCC和结直肠癌中的比例偏高，可能是由于皮肤和肠道是抵御外界侵袭的第一道屏障，其本身就具有对刺激反应的特异性免疫系统[55,56],因此，高TLS浸润的微环境也许可以通过 刺激或调节免疫功能来有效增强抗肿瘤免 疫。

与此同时，在TLS加强肿瘤抑制时，其也可能促进正常组织的自身免疫反应。随着肿瘤内或肿瘤旁TLS形成和成熟，释放了大量的相关抗原，进一步激活的免疫细胞经血液循环流入正常组织结构，对具有相同抗原的自身组织同样作用，造成了自身免疫反应[57]。尽管相关事件的数据很少，但不能忽视其可能引发的免疫相关不良后果，仍需进一步探究如何更好的利用TLS来抑制肿瘤。

4、总结与展望

TLSs在多种癌症中预后和治疗的预测价值使得其有机会作为潜在的肿瘤标志物。由于定义和描述TLS的标志物在各种研究中往往不同，这使得难以统一化比较其预测价值和异质性。因此，探寻标准化的方法来确定TLS数量、组成和成熟度可以进一步揭示它们在不同癌症中的预测和预后价值。目前对于TLS的研究主要是通过H&E染色和IHC来进行，但这存在诸多局限性，比如消耗过多临床样本，无法进行定量分析，也难以探究TLS与TIME之间的结合和潜在作用，因而我们有必要发掘其他更可靠有力的验证方法，例如多重荧光免疫组化(multiplex immunohistochemistry, mIHC)、数字空间多组学分析技术(digital spatial profiler, DSP)等等。而人工智能作为目前的热门技术也可以加以利用，通过机器学习来标准化TLS的识别和评估，其可重复性可以在预测和治疗中发挥巨大作用。

TIME作为由不同类型免疫群体组成的复杂网络，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，同时也对预后或治疗效果产生重要影响。以往关于TIME的研究大多强调了单个免疫细胞类型的重要性，TLS在癌症中的有利作用也已得到诸多认可，因而我们需要进一步探究TLS作为整合固有免疫和适应性免疫群体参与抗肿瘤反应的功能实体的作用。由于TLS在不同癌症中存在异质性，所以这种异质性是否也存在于原发肿瘤和复发肿瘤之间，也需要我们更加深入的探究。

参考文献:

[54]章杭,沈晓燕,杨杨,等.三级淋巴结构在非小细胞肺癌中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2017,25(13):2183-2186.

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:82103121);江苏省自然科学基金项目(编号:BK20200878);苏州大学大学生课外学术科研基金重点项目(编号:KY2023093A);

文章来源:张金金,陈琳,荣超.三级淋巴结构在恶性实体瘤患者预后及免疫治疗中的作用研究进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(10):1907-1912.