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扶正挽肝颗粒水提工艺及质量标准研究

2024-01-04 50 上传者：管理员

摘要：目的:优选扶正挽肝颗粒的水提工艺，并建立扶正挽肝颗粒的质量标准控制方法。方法:通过正交L9(34)试验选取加水量、煎煮时间及煎煮次数三个因素的最佳指标，选择干膏出膏率作为评价指标，确定扶正挽肝颗粒的最佳水提工艺。以薄层色谱法(TLC),对白芍和柴胡两味药材进行定性鉴别，开展剂型的粒度、水分、溶化性、装量差异、微生物限度等常规项检查。结果:扶正挽肝颗粒的最佳水提工艺为加8倍水量、煎煮3次，每次煎煮时间为1.0 h;白芍、柴胡样品薄层色谱斑点清晰，阴性无干扰；该水提工艺提取的颗粒样品粒度、水分、溶化性、装量差异和微生物限度等常规项检查均符合2020版《中华人民共和国药典》第四部“颗粒剂”项下相关规定。结论:该研究优选出的水提工艺符合扶正挽肝颗粒的生产需要，所制定的扶正挽肝颗粒质量控制方法稳定、可行。

关键词：
扶正挽肝颗粒
抑制细胞增殖
水提工艺优化
薄层鉴别
质量标准
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原发性肝癌是起源于肝细胞及肝胆管细胞的一种难治性恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。根据GLOBOCAN(2020)统计数据显示，全球原发性肝癌的新发病例数约为90.6万，死亡病例数约为83万[1]。在我国，原发性肝癌的发病和死亡病例数约占全球的1/2,其伤残调整寿命年(disability adjusted life year, DALY)在所有恶性肿瘤中居世界第一位[2],这些都表明我国正承受着严重的原发性肝癌疾病负担。目前，西医治疗原发性肝癌的方法包括肝切除术、局部消融、局部栓塞、全身化疗、靶向药物治疗等[3],这些治疗方法可在一定程度上减少细胞凋亡，延缓肝癌的恶性进展。但是由于肝源严重匮乏，住院治疗费用高昂，耐药性、复发率、不良反应发生率高等问题，肝癌的治疗受到了很大限制。中药具有调节免疫、抑制细胞增殖、干扰细胞能量代谢、遏制或杀伤肿瘤细胞等综合作用[4,5],还有不良反应少等优点，在治疗肝癌中具有较大优势。因此，开发具有疗效好、副作用低的中药防治原发性肝癌具有非常重要的意义。

本研究通过深入钻研原发性肝癌的病理及发病机制并结合多年临床经验，提出肝癌中医“虚瘀失肝”新认识，即慢性肝病持续恶性进展的中医“肝正虚邪胜”本质及“瘀”贯穿疾病始终的基本特性[6,7]。扶正挽肝颗粒是在“虚瘀失肝”新认识基础上形成的方药，该方由干地黄、茵陈、姜黄、白芍、百合、鳖甲等药物组成。方中干地黄味甘、寒，甘入脾，脾气和则气血生化有原，血充则经脉通畅；甘主缓，抑肝火平肝气以缓急止痛；寒为阴入肾，充养精髓，肾者肝之母，精生则血生，阴可治阳，起生血敛阳，敛藏肝火之效，现代药理研究表明，地黄具有刺激粒系造血祖细胞升高、抑制细菌生长、抑制骨髓细胞凋亡及抑制血管内皮素释放等功效[8]。鳖甲味咸、性平，咸入肾补肾精，鳖甲居水中主动，为阴中之阳，肝者亦阴中之阳也，鳖甲可入肝软坚散结。研究表明鳖甲可抑制生长因子表达、阻断血管生成，从而起到防治肿瘤的作用[9]。百合性平，养肺，以佐金平木；味甘入脾，既可健脾抑肝，防止肝气乘脾，达“先安未受邪之地”之效；又能缓急止痛，治疗肝区疼痛之症。茵陈性平味苦，主治邪气热结、风寒湿热、黄疸等，现代药理研究表明，茵陈具有扩宽胆管、促进胆汁分泌、辅助肝脏解毒、促进肝细胞再生、防止肝坏死等作用[10]。柴胡味苦入足少阳胆经，能升发少阳郁气，使胆汁疏泄有度，助胃消化食物，以除胃肠积食，又能透邪解表达退黄之效；有研究发现，柴胡小分子可与乙肝病毒多靶点结合从而抑制乙肝病毒在肝脏内的复制[11]。全方贯穿补肾调肝治脾的治疗原则，旨在补肾生髓以补肝虚、疏肝柔肝化肝、健脾祛浊、软坚散结，气行血调，阴阳平和，正气得复，则病邪自除。

为了更好发挥扶正挽肝颗粒的药效及保障其临床使用的安全性，本研究采用正交L9(34)试验优化其水提工艺，并通过薄层色谱鉴别法，按照《中华人民共和国药典》规定的方法对水分、总灰分、浸出物进行测定，以期在保证质量稳定的前提下，为肝病患者提供品质更优的纯中药颗粒制剂。

1、材料

1.1 仪器

中药提取器(湖南衡阳市金一帆制药设备实业有有限公司，型号：100836);YOKO-CS型紫外线反射透射成像仪(武汉药科新技术开发有限公司，型号：YOKO-CS);500L单效真空浓缩器(武汉华荣鼎昌轻工设备有限公司，型号：WZ-500);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9240A);电子天平(日本AND电子天平有限公司，型号：GH-252);立式压力蒸汽灭菌器(江苏张家港市华菱医疗设备制造有限公司，型号：YM75);摇摆式制粒机(南京腾涌干热设备有限公司，型号：YK-80);自动颗粒包装机(天津市三桥包装机械有限公司)。

1.2 试药

扶正挽肝颗粒(批号：20220708、20220710、20220803)由广西中医药大学第一附属医院中药房提供；柴胡对照药材(批号：120992-201509)和芍药苷对照品(批号：110736-202044)均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G板(10 mm×10 mm, 批号：20220623)购于青岛海洋化工厂；三氯甲烷、正丁醇和浓氨水等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2、方法与结果

2.1 水提工艺

2.1.1 正交实验设计

按处方比例称取药材(生地黄150 g, 茵陈120 g, 姜黄90 g, 白芍90 g, 柴胡90 g, 苍术120 g, 茯苓120 g, 人参90 g, 浙贝母120 g, 桃仁90 g, 鳖甲120 g, 水蛭60 g, 三棱60 g, 莪术60 g, 甘草30 g, 合计1 530 g),应用传统水煎煮法进行提取，采用L9(34)正交试验对加水量、煎煮次数、煎煮时间三个因素进行研究，每个因素选择3个水平。见表1。

表1 提取条件及因素水平

2.1.2 干膏出膏率考察

吸取扶正挽肝颗粒水提液30 mL置于干燥的蒸发皿中，水浴蒸干后将蒸发皿转移至105 ℃烘箱干燥3 h, 取出，置于干燥器中冷却30 min, 称定干膏质量，按公式(M1-M0)V/30m计算干膏出膏率，M1为干膏与蒸发皿总质量，M0为空蒸发皿质量，V为水提液总体积，m为提取饮片质量。

2.1.3 结果分析

以干膏出膏率为评价指标，按各因素对考察指标的影响程度进行排序，依次为煎煮次数(B)、加水量(A)、煎煮时间(C)。对实验数据进行方差分析表明，煎煮次数的影响程度最具显著性，加水量和煎煮时间的影响程度无统计学差异。最优条件为A2B3C1,即提取工艺：加8倍水量，煎煮3次，每次煎煮时间为1.0 h。实测结果见表2,方差分析结果见表3。

表2 提取条件正交试验结果

表3 方差分析

2.1.4 正交实验结果验证

称取6份扶正挽肝颗粒，根据优选出来的水提工艺条件，即加8倍水量、煎煮提取3次、每次煎煮时间1.0 h, 进行6组平行验证试验。投料量、考察指标、测定方法均同“2.1.1”项及“2.1.2”项，结果验证试验的干膏出膏率平均值为35.54%,RSD为2.99%。见表4。

表4 验证结果

2.2 质量标准研究

2.2.1 柴胡的定性鉴别

取扶正挽肝颗粒20 g, 加入乙醇50 mL,超声处理30 min, 过滤，取滤液水浴蒸干；加纯水20 mL将其溶解并置于分液漏斗中，加入氯仿萃取2次，每次20 mL,弃去氯仿；再加入水饱和正丁醇萃取2次，每次20 mL,收集上层正丁醇液；加20 mL氨试液洗涤2次，弃去氨试液；加50 mL正丁醇饱和水溶液洗涤，弃水液，正丁醇液水浴蒸干，加甲醇1 mL溶解作为供试品溶液。阴性样品溶液同法制备。另取柴胡对照药材1 g同法制备，作为对照药材溶液。参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502“薄层色谱法试验”,吸取供试品溶液3 μL、对照药材溶液5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以10 ℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以含2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，分别置于日光灯及波长为365 nm的紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，而阴性无干扰。见图1。

图1 柴胡薄层鉴别

2.2.2 白芍的定性鉴别

取扶正挽干颗粒10 g, 加入乙醇50 mL,超声处理30 min, 过滤，滤液水浴蒸干，加纯水20 mL溶解置于分液漏斗中，加入三氯甲烷萃取3次，每次20 mL,弃去三氯甲烷；再加入水饱和正丁醇萃取3次，每次20 mL,收集上层正丁醇液；加20 mL氨试液洗涤3次，弃去氨试液；加50 mL正丁醇饱和水溶液洗涤，弃水液，正丁醇液水浴蒸干，加甲醇1 mL溶解作为供试品溶液。取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。缺白芍阴性样品按供试品溶液制备方法制备。参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502“薄层色谱法试验”,分别吸取供试品溶液、缺白芍阴性溶液各10 μL、芍药苷对照品溶液2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以10 ℃以下放置的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶12∶0.2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点清晰，日光下进行观察。结果供试品色谱中，在与芍药苷对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图2。

2.3 剂型的常规检查

2.3.1 粒度

按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0104“颗粒剂”项下“粒度” 项检查了3批样品(批号：20220708、20220710、20220803),不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15%。结果显示，3批样品不能通过一号筛与能通过五号筛的总和分别为4.21%、5.10%、5.78%,均未超过15%,均符合规定。结果见表5。

图2 白芍薄层鉴别

表5 扶正挽肝颗粒粒度检验结果 (%)

2.3.2 水分

按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0832“水分测定法”检查了3批样品(批号：20220708、20220710、20220803),水分不得超过8.0%。结果显示3批样品水分分别为：4.13%、4.67%、4.56%,均未超过8.0%,均符合规定。结果见表6。

表6 扶正挽肝颗粒水分检验结果 (%)

2.3.3 溶化性

取供试品1袋，加热水200 mL,搅拌5 min, 立即观察。共检查了3批样品(批号：20220708、20220710、20220803),结果3批样品颗粒均全部溶化，有轻微浑浊，未见焦屑等异物。

2.3.4 装量差异

按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0104“颗粒剂”项下“装量差异”检查3批样品(批号：20220708、20220710、20220803)。取供试品每批均10袋，除去包装，分别精密称定每袋内容物的质量，求出每袋内容物的装量与平均装量。装量差异限度标准为标示装量的±5%(即：11.40～12.60 g),每袋装量与标示装量相比较，超出装量差异限度的颗粒剂不得多于2袋，并且不能有1袋超出装量差异限度1倍。结果显示3批样品的装量差异限度均在许可范围内，均符合规定。见表7。

表7 扶正挽肝颗粒装量差异 (g)

2.3.5 微生物限度

本品为口服给药固体制剂，由地黄、茵陈和人参等15味中药材经提取制成，本品不含药材原粉。根据其用药途径和处方，应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定及控制菌-大肠埃希菌检查。按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105、1106“非无菌产品微生物限度检查法”有关规定，进行计数方法适用性试验，建立微生物限度检查方法。试验结果，见表8。

表8 扶正挽肝颗粒微生物限度检查

3、讨论

传统汤剂在煎煮过程中由于加水倍数、煎煮时间、次数等存在差异，导致汤剂疗效发挥不稳定；且汤剂存在口感差、难以保存、不便携带等缺点[12]。因此将传统汤剂开发成颗粒剂能稳定质量、改善口感、便于储存和携带。本研究从扶正挽肝颗粒的水提工艺、定性鉴别以及剂型的常规检查三个方面展开研究，较全面地论证了扶正挽肝颗粒的质量稳定性。

扶正挽肝颗粒由15味中药组成，组方新颖，疗效确切，在临床运用时以汤剂为主。因此本颗粒剂在制作时采用水煎煮法，综合考虑了药材本身的吸水因素，通过正交实验，以干膏出膏率为考察指标进行综合评价，确定出最佳煎煮工艺为：加8倍水量，煎煮3次，每次煎煮时间为1.0 h。研究证实，该方法可保证扶正挽干颗粒制剂中有效成分的含量。

本研究分别对柴胡、白芍进行了薄层色谱鉴别，二者的薄层鉴别斑点清晰、分离度高、阴性对照无干扰，且重现性好，可作为扶正挽肝颗粒质量的控制方法。通过对该工艺制备的扶正挽肝颗粒质量进行考察，粒度、水分、装量差异均符合规定，溶化性好；并且成本质量稳定，且质控简便，有利于降低生产成本，适合工业大规模生产。

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