高尿酸血症是一种以尿酸含量升高为标志的代谢性疾病，是继高血糖、高血压和高血脂之后的“第四高”疾病，严重危害人体健康[1]。流行病学调查结果表明，高尿酸血症是痛风的主要病理基础，尿酸水平升高还与糖尿病和心脑血管、胃肠道疾病等密切相关[1-2]。高含量尿酸会进一步诱导超氧阴离子大量分泌，加剧体内氧化应激反应，形成恶性循环，最终造成机体代谢紊乱和肝肾功能损害[3]。黄嘌呤氧化酶（xathine oxidase,XOD）作为尿酸代谢关键酶，是高尿酸血症或痛风防治的关键靶点[3-4]。别嘌醇是典型的XOD抑制剂，也是临床上用于治疗高尿酸血症的主要药物，包括别嘌醇在内的西药普遍存在副作用（如过敏、肝毒性和头痛等），临床应用受到限制[5]。天然产物具有无毒、安全可靠等优势，是开发活性成分的宝贵资源。近年来，从天然产物寻找具有良好降尿酸功效活性分子的研究备受关注。

灵芝（Ganoderma lucidum）富含多糖、三萜、生物碱、蛋白质（肽、氨基酸）等多种活性成分，药用历史已有2000年。现代科学研究表明，灵芝具有增强免疫力、保肝、营养神经、抗肿瘤等生物活性，已成为当今保健食品的主要原料之一[6-7]。已有研究表明，灵芝水提物可增加尿酸排泄，改善肝肾炎症反应[8]。关于灵芝改善高尿酸血症的作用机制尚不清晰。笔者采用腺苷诱导肝细胞L-O2建立体外高尿酸细胞模型，并基于氧嗪酸钾联合酵母膏喂养建立的高尿酸大鼠模型，研究灵芝水提物对高尿酸血症的影响，以期为灵芝抗高尿酸血症功能性产品的开发提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

灵芝（G.lucidum）‘沪农灵芝4号’子实体由上海市农业科学院食用菌研究所提供；肝细胞L-O2购自泰斯拓生物技术有限责任公司；饲料和高嘌呤饲料（含10%酵母干粉和0.1%腺嘌呤）购自江苏省协同生物工程有限责任公司。

1.2实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，（200±20) g,2月龄，购自上海斯莱克动物实验公司；所有实验过程严格按照国家实验动物福利伦理的相关规定，获上海睿太莫斯生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准[许可证号：202311(19）]。

1.3主要试剂和仪器

尿酸，血肌酐，尿素氮，黄嘌呤氧化酶、总蛋白质定量测定试剂盒（南京建成科技有限公司）；腺苷、别嘌醇、黄嘌呤氧化酶、3,5-二硝基水杨酸（上海源叶生物科技公司）；胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、二铵盐[2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS]（美国SigmaAldrich公司）。

Synergy HT酶标仪（美国Bio-Tek公司）；BC-R2001旋转蒸发仪（上海贝凯生物化工设备有限公司）；5810R离心机（德国Eppendorf公司）；Heto Power Dry LL3000冷冻干燥机、Steri-Cycle 371CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）。

1.4灵芝水提物制备

将灵芝子实体50℃烘干72 h，粉碎过孔径0.15 mm筛，取100 g粉末，加入1.9 L蒸馏水浸泡30 min，煮沸1 h,7 100 g离心10 min，提取2次，合并上清液，浓缩冻干后得到灵芝水提物。

1.5灵芝水提物中糖类、蛋白质和核苷类物质含量测定

参照文献[9-13]的方法，分别测定灵芝水提物中的总糖、还原糖、多糖、蛋白质和核苷类物质含量。

1.6灵芝水提物体外抗氧化活性测定

参照文献[14]的方法，测定灵芝水提物（低、中、高剂量分别为0.25、0.50、1.00 mg·m L-1）对DPPH和ABTS自由基清除能力。

1.7灵芝水提物对腺苷诱导的高尿酸细胞模型的降尿酸作用

参照文献[15]的方法培养肝细胞L-O2。在96孔板中，每孔加入100µL L-O2细胞悬液（含1×104个），37℃培养24 h后，对照组培养基更换为90µL无血清培养基，其他组更换为含0.001 mol·L-1腺苷的90µL无血清培养基，37℃培养24 h，灵芝水提物组（低、中、高剂量分别为0.25、0.50、1.00 mg·m L-1）加入10µL灵芝水提物；阳性组加入10µL 0.500 mmol·L-1别嘌醇；对照组和模型组加入等体积PBS,37℃孵育2 h，所有实验组加入10µL 5.000 U·µL-1黄嘌呤氧化酶，37℃培养24 h，参照试剂盒说明书测定培养液中尿酸含量。

1.8灵芝水提物对高尿酸血症大鼠的降尿酸作用

1.8.1实验动物分组和给药

将30只SD大鼠，随机分为6组，每组5只。对照组喂正常饲料，其他组喂高嘌呤饲料并每日灌胃750 mg·kg-1氧嗪酸钾和21 g·kg-1酵母膏以建立高尿酸模型。阳性组每日灌胃0.02 L·kg-1的5 mg·m L-1别嘌醇，灵芝水提物组（低、中、高剂量分别为0.5、1.0和2.0 g·kg-1）分别灌胃0.02 L·kg-1灵芝水提物，对照组灌胃蒸馏水，每日1次，灌胃21 d，腹腔注射5.0 m L·kg-1的1%戊巴比妥钠溶液，心脏采血，并剥离肝脏、肾脏组织，分别置于–80℃或多聚甲醛固定溶液中保存，用于后续分析。

1.8.2相关生化指标检测

血清和肝脏组织黄嘌呤氧化酶活性，血清和肾脏组织尿酸含量以及血清肌酐、尿素氮含量测定参照试剂盒说明书进行。

1.8.3组织病理学检测

参照文献[16]的方法将固定在多聚甲醛固定溶液中的肝脏、肾脏组织用石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，并用光学显微镜观察组织细胞形态，采用image J软件对肾脏、肝脏组织细胞的核质比进行分析。

1.9统计分析

采用Graph Pad Prism 7软件进行统计学分析，采用单因素方差分析比较各实验组差异，P<0.05表示差异具有显著性。

2、结果与分析

2.1灵芝水提物中糖类、蛋白质和核苷类物质的含量

灵芝水提物的得率为7.890%；总糖含量为30.970%，其中还原糖含量为8.789%，多糖含量为22.180%；蛋白质含量为28.300%；核苷类物质的总含量为1.981%，其中含量最高的为尿苷（0.691%），其次为鸟苷（0.419%），作为XOD直接底物的次黄嘌呤含量为0.024%（图1）。

图1 核苷类化合物标准品（Ⅰ）和灵芝水提物（Ⅱ）的HPLC图谱

2.2灵芝水提物体外抗氧化活性

在实验范围内，随着质量浓度增加，灵芝水提物对ABTS和DPPH清除率逐渐增加，0.25、0.50和1.00 mg·m L-1灵芝水提物对DPPH的清除率显著高于其对ABTS的清除率（图2）。

图2 灵芝水提物体外抗氧化活性

2.3灵芝水提物对腺苷诱导肝细胞尿酸合成的抑制作用

与对照组比较，模型组培养液中的尿酸含量显著增加。与模型组比较，灵芝水提物低、中、高剂量组培养液中的尿酸含量显著降低，分别为14.83、11.11、18.50µmol·m L-1（图3）。

图3 灵芝水提物对肝细胞尿酸合成的影响

2.4灵芝水提物对高尿酸血症大鼠的抗尿酸作用

2.4.1灵芝水提物对高尿酸血症大鼠尿酸含量的影响

与对照组比较，模型组血清中的尿酸含量极显著增加。与模型组比较，灵芝水提物中、高剂量组血清中的尿酸含量分别显著、极显著降低，为123.83、108.01µmol·L-1（图4Ⅰ）。与对照组比较，模型组肾脏中的尿酸含量极显著降低。与模型组比较，灵芝水提物低剂量组肾脏中的尿酸含量显著增加，为26.88µmol·g-1；中、高剂量组极显著增加，分别为29.68、38.89µmol·g-1（图4Ⅱ）。结果说明，灵芝水提物可有效促进尿酸排泄，降低高尿酸血症大鼠尿酸含量。

图4 灵芝水提物对高尿酸血症大鼠血清（Ⅰ）和肾脏（Ⅱ）尿酸含量的影响

2.4.2灵芝水提物对高尿酸血症大鼠肾脏和肝脏组织的影响

与对照组比较，模型组肾脏组织出现肿胀、空泡化，肾小管腔扩大，肾小球萎缩等病理损伤；与模型组比较，灵芝水提物灌胃干预后可改善高尿酸大鼠肾脏组织的病理损伤状态（图5Ⅰ）。与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织细胞的核质比极显著增加；与模型组比较，灵芝水提物中、高剂量组肾脏组织细胞的核质比显著降低（图5Ⅱ）。与对照组比较，模型组大鼠血清尿素氮、肌酐含量极显著增加；与模型组比较，灵芝水提物中、高剂量组血清尿素氮含量分别显著、极显著降低，为10.20、7.35 mmol·L-1（图5Ⅲ）；低、中、高剂量组血清肌酐含量极显著降低，分别为79.28、63.92、48.31 mmol·L-1（图5Ⅳ）。

图5 灵芝水提物对高尿酸血症大鼠肾功能的影响

2.4.3灵芝水提物对高尿酸血症大鼠血清和肝脏组织中XOD活性的影响

与对照组比较，模型组血清中的XOD活性极显著增加；与模型组比较，灵芝水提物中、高剂量组血清XOD活性分别显著、极显著降低，为24.45、20.16 U·L-1（图7Ⅰ）。与对照组比较，模型组肝脏组织中的XOD活性极显著增加；与模型组比较，灵芝水提物中、高剂量组肝脏组织XOD活性分别显著、极显著降低，为5.64、3.70 U·g-1（图7Ⅱ）。结果说明，灵芝水提物对XOD活性具有明显抑制作用。

图6 灵芝水提物对高尿酸血症大鼠肝脏组织的影响

图7 灵芝水提物对高尿酸血症大鼠血清（Ⅰ）和肝脏组织（Ⅱ）中XOD活性的影响

3、讨论

次黄嘌呤在XOD的作用下生成尿酸，其是嘌呤代谢的终末产物；肝脏是XOD的高表达器官，亦是尿酸的主要生成场所，体内70%的尿酸经肾脏排泄[17]。因此，促进肝脏合成尿酸或抑制肾脏排泄尿酸均会导致尿酸含量升高，进而引起高尿酸血症发生。鉴于目前临床上常用药物多伴有引起发热、过敏等副作用，从天然产物中寻找缓解高尿酸血症的生物活性分子尤为重要。已有研究表明，西红花、白子菜等天然植物水提物可通过抑制XOD活性，降低尿酸和血清肌酐、尿素氮等含量，改善高尿酸血症大鼠的肾功能损伤[18-19]。食药用菌营养丰富，成为近年来抗高尿酸血症研究的热点。灵芝作为我国重要的食药用菌，药用价值高，无毒副作用，受到广泛关注和研究。灵芝糖肽[8]、酚类[20]和黄酮类[20]等物质均可发挥降尿酸作用，HUANG等[20]指出灵芝的酚类和黄酮类物质对高尿酸血症的缓解作用较好，多糖组分在改善肾脏、肝脏功能等方面效果更佳。

笔者发现灵芝水提物富含多糖和蛋白质组分；次黄嘌呤含量较低（0.024%），明显低于大多数鱼虾类（如虾类、鲈鱼、黄鱼等次黄嘌呤含量为0.07%～0.13%)[21]，这为灵芝改善高尿酸血症提供有利条件。此外，灵芝水提物可显著降低高尿酸血症大鼠血清中的尿酸含量和血清、肝脏中的XOD活性。XOD是肝脏合成尿酸的关键限速酶，抑制XOD活性已成为临床中一些降尿酸药物的主要药理活性基础[22-23]。高含量尿酸会破坏氧化-还原系统，扩大机体中的氧化应激反应，加剧肾功能损伤。因此，抑制XOD活性和提高抗氧化活性可能是灵芝水提物发挥抗高尿酸血症的重要原因。桑黄（Sanghuangporus vaninii）、蛹虫草（Cordyceps militaris）等食药用菌对XOD活性、炎症反应等具有抑制作用，可缓解肝脏和肾脏组织的病理损伤，进而发挥抗高尿酸血症作用[24-25]。不同食用菌抗高尿酸血症作用机制可能与其活性组分差异有关。已有研究表明，灵芝多糖和蛋白质水提物均具有显著抗氧化作用，可剂量依赖性清除DPPH、ABTS自由基[26-27]，抑制脂质过氧化物生成，提高损伤组织中超氧化物歧化酶活性等[26]。袁荣高等[28]发现灵芝多糖通过改善糖尿病大鼠氧化应激反应和抑制肾脏细胞凋亡，保护糖尿病大鼠肾功能，说明灵芝多糖在抗氧化和益肾等方面具有良好效果。此外，灵芝水提物中的麦角硫因具有很强的抗氧化性和XOD活性抑制作用，其为降尿酸功效提供理论基础[29]。综上所述，灵芝水提物具有良好抗高尿酸血症作用，可能与抑制XOD活性和改善氧化应激反应有关，但灵芝水提物成分复杂，具体抗高尿酸血症的活性分子有待进一步研究。

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基金资助:国家现代农业产业技术体系(CARS-20); 上海市农业科学院卓越团队建设计划[沪农科卓(2022)003];

文章来源:刘朋,刘利平,熊心怡,等.灵芝水提物对高尿酸血症大鼠尿酸含量和肾功能的影响[J].食用菌学报,2024,31(05):95-103.