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单采血小板不同存储时间活化状态和微粒表达及个体差异分析

2024-09-25 130 上传者：管理员

摘要：目的分析单采血小板保存时间对血小板活化的影响及献血者个体差异与采集后血小板活化状态的关系，为采供血机构血小板采集工作及临床个性化输注提供参考。方法随机收集2023年90例捐献者的单采血小板，随机保存1、2、3、4、7天，共5组。采用流式细胞仪检测各组血小板微粒(PMPs)、活化指标CD62p，进行统计学分析。收集各捐献者一般体检数据、捐献前血液检测数据和采集参数等数据，分析其与PMPs和血小板活化的关系。分析PMPs和CD62p的关系。结果储存1、2、3、4、7天的血小板CD62p表达率分别为(61.55±20.17)%、(69.05±13.09)%、(64.63±12.89)%、(70.34±9.504)%、(84.28±6.303)%；PMPs表达率分别为：(6.79±9.17)%、(7.01±9.13)%、(12.37±12.64)%、(7.51±5.70)%、(17.02±7.20)%；PMPs数量(×10～3/μL)分别为：2.69±4.84、4.80±9.20、3.59±3.38、7.94±8.89、145.1±190.3。单因素方差分析显示不同存储时长的各组单采血小板CD62p表达和PMPs表达存在显著差异(P<0.05)。各组两两比较，储存7天的血小板CD62p表达率和PMPs数量明显高于储存1、2、3、4天的血小板；其他各组间无明显差异。随储存时间的延长，血小板活化率和PMPs数量呈增长趋势。Pearson双变量分析显示，血小板采集后最初PMPs数量与捐献者脉搏和白细胞数目呈正相关(P<0.05)，与其他因素无明显相关性；CD62p与PMPs的表达呈正相关(P<0.05)。结论单采血小板在保存4天时间内，活化和PMPs的表达无明显变化，之后出现活化和PMPs的表达增加的特点(P<0.05)。血小板采集后的活化与个体差异有关。可依据血小板储存过程中的活化和PMPs表达的特点选择相应产品应用临床。

关键词：
个性化输注
单采血小板
血小板存储
血小板微粒
血小板活化
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单采血小板采集自动化程度高，采集后保存质量稳定，现已成为采供血机构提供的最主要血小板品种。单采血小板输注是目前成熟的现代成分输血的重要方式，是预防、治疗临床患者血小板减少和血小板功能障碍相关疾病的主要治疗手段。影响血小板输注效果的因素有很多[1]，然而，血小板的活化损伤是影响血小板体内回收率和存活率的重要因素[2]。血小板在存储过程中会产生损伤[3]，且这与血小板细胞因子、黏附因子等水平变化关系密切[4]。本研究分析血小板保存时间对血小板活化影响的特点，并探讨献血者的个体差异与采集后血小板活化状态的关系，为采供血机构血小板采集工作及临床个性化输注提供相关参考。

一、材料与方法

1 样本来源和留取方式

随机收集2023年常州市中心血站单采单份血小板献血者90例样本，捐献者的体检和血液检测标准符合《献血者健康检查标准》[5]，本项目已获常州市中心血站伦理委员会审核。血小板单份采集后，将5～10 mL血小板留存至多余的保存袋，立即放于血小板振荡保存箱中，保存温度为(22±2)℃，振荡频率为60次/分[6]，分别保存1、2、3、4、7天，共5组，每组例数见表1。单采血小板符合《全血及成分血质量要求》[7]，血小板运输按照《血液运输标准》[8]要求，运输时间不超过1.5 h。

2 仪器与试剂

单采血小板仪(Haemonetics MCS+)；血小板恒温震荡保存箱(苏州市医用仪器厂)；流式细胞仪(FC500，Beckman Coulter)；抗-CD62p-FITC单克隆抗体(Cat:304904)购自美国BioLegend公司；抗-CD41抗体(Cat:A07781)购自美国贝克曼库尔特公司；荧光微球购自辉质生物；血细胞计数仪(XP100,sysmex)。

3 方法

3.1 流式细胞仪检测CD62p表达率

将100 μL采集的血小板与5 μL抗-CD62p-FITC单克隆抗体或空白对照混匀后室温避光、孵育40 min，加入1 mL PBS洗涤后，1 500 r/min离心10 min，弃上清，重悬于500 μL PBS后转移至流式管中，用流式细胞仪检测血小板的活化状态。计数至少10 000个血小板，分别检测阳性表达率和荧光强度。为减少血小板活化的环境干预，血小板离开保存袋后1 h内尽快处理检测。

3.2 PMPs的获取和分析

采用差速离心法分离获取血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)。在4 ℃条件下11 000×g离心2 min，获得贫血小板血浆(PPP)。PPP在4 ℃条件下，1 300×g离心45 min，吸取上清得到PMPs。将分离的PMPs重悬在改良的Tyrode缓冲液(0.4 mmol/LNaH2PO4、5 mmol/L HEPES、0.1%葡萄糖和0.35%牛血清白蛋白，PH7.2)中，将100 μL PMPs与5 μL FITC标记的抗人CD41抗体室温孵育45 min，空白对照不加抗体。加入1 mL PBS洗涤后1 500 r/min离心10 min，弃上清，重悬于500 μL PBS后转移至流式管中，用流式细胞仪进行检测。设门测率由前向(FSC)和侧向(SSC)分散进行设置。PMPs是CD41+的颗粒，绝对浓度以5 μm微球的浓度进行计算[9]。

3.3 资料收集

收集捐献者一般体检数据(身高、体重、脉搏、血压、年龄)；捐献前血液检测数据(WBC、HCT、Hb、ALT、PLT)、单采数据(循环血量、抗凝剂用量)。本研究均获得患者的知情同意。

4 统计学分析

所有数据采用GraphPad Prism 9软件进行分析。计量数据以均数±标准差()表示，正态分布的变量采用描述性统计分析和单因素方差分析(ANOVA)，各组间两两比较采用Bonferroni法(如果数据方差具有齐性)或Dunnett T3法(如果数据方差不具有齐性)；Pearson相关性分析用来检验各变量间的相关性，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

二、结果

1 捐献者基本资料

随机选取的血小板捐献者每组男性数量均明显多于女性，且每组年龄分布无明显差异(P>0.05)，见表1。

表1 捐献者基本资料

2 不同存储时间单采血小板活化程度

不同保存时间的血小板CD62p的表达率见图1和表2。单因素方差分析显示，CD62p表达率各组存在显著差异(P<0.000 1)。进一步各组两两比较分析，7 day组CD62p表达率显著高于1、2、3、4 day组，P<0.05；1、2、3、4 day组间比较均无明显差异。CD62p表达率随血小板保存时长增加呈升高趋势；CD62p表达平均荧光强度各组存在显著差异(P=0.004 1)，进一步各组两两比较分析，除3 day组和7 day组有差异外，其余各组比较无明显差异。见图2。

3 不同存储时长单采血小板微粒的表达率和绝对计数

不同保存时间的血小板CD41+PMPs的表达率和绝对数量见图3和表3。单因素方差分析显示，CD41+PMPs表达率各组存在显著差异(P=0.001 2)。进一步各组两两比较分析，7 day组CD41+PMPs表达率显著高于1、2、4 day组，P<0.05；与3day组无明显差异，P>0.05；1、2、3、4 day组间比较均无明显差异。CD41+PMPs表达率随血小板保存时间增长呈现升高趋势；CD41+PMPs绝对数量各组存在显著差异(P=0.004 1)，进一步各组两两比较分析，7 day组CD41+PMPs绝对计数显著高于1、2、3、4 day组，P<0.05；1、2、3、4 day组间比较无明显差异。见图4。

图1 流式细胞仪分析不同存储时间血小板的CD62p表达率

4 CD62p表达率和CD41+PMPs数量与各变量间Pearson双变量相关分析

表3 CD41+PMPs表达

由结果2和3可知，血小板在保存时间四天内，CD62p表达率和CD41+PMPs数量无差异，因此将1、2、3、4 day组样本纳入该分析，评价各变量与血小板采集后最初活化状态的关系。结果显示，CD62p表达率与各变量无明显相关；CD41+PMPs数量分别与脉搏和白细胞数呈正相关，P<0.05，见表4。

图2 不同存储时间血小板的CD62p表达率和荧光强度变化趋势

图3 流式细胞术分析不同存储时长血小板的微粒表达率

表2 血小板CD62p表达

5 CD62p表达率与CD41+PMPs表达率和数量间Pearson双变量相关分析

90例样本全部纳入该分析，结果显示，CD62p表达率与CD41+PMPs表达率正相关(r=0.433 8,P<0.000 1)；CD62p表达率与CD41+PMPs数量正相关(r=0.364 1,P=0.000 4)，见图5。

三、讨论

现行标准规定，单采血小板在(20～24) ℃ 持续轻缓振荡条件下可保存5天。研究表明，输入保存期增加的血小板，发生输血不良反应事件会增加，尤其发热反应事件递增明显[10]。血小板CD62p，又称血小板P选择素，是一种主要位于血小板α颗粒、血管内皮细胞膜的糖蛋白，血小板未发生活化时其表面不表达CD62p，当血小板受到刺激被激活时则使质膜与血小板α颗粒膜发生相互作用，导致CD62p在质膜上表达，其表达率是临床上预测血小板存活率的重要标志[11]。目前主要用血小板计数评估血小板质量，但血小板计数在不同保存期、不同保存温度下基本无变化，因为血小板在血细胞计数仪检测中以颗粒方式出现，只与大小及形状有关，与功能特性没有关系，并不能证实血小板功能，因此对血小板体外功能检测是很有必要的[12]。血小板微粒(platelet microparticle,PMPs)占细胞微粒总数的(70～90)%[13]，是活化或凋亡的血小板出芽脱落形成的一种超微囊泡结构，为血小板膜颗粒，最早作为血小板粘附于血管壁后的释放物被研究，被视为体内血小板活化的标志物；在电镜下直径介于100～100 nm之间[14]。PMPs既含有血小板膜蛋白和膜脂质，也特异性表达血小板表面标记，例如GPⅡb(CD41)等[15]。血浆中(70～90)%的微粒是从激活的血小板中释放出来的。Flaumenhaft等[16]证明了巨核细胞也能产生CD41/CD61+微粒。本研究初步表明血小板存储过程中活化情况的特点，随着保存时间的增加，血小板在4天内活化无明显变化，第四天开始活化呈明显增加趋势；CD62p表达率与CD41+PMPs数量均呈现随保存时长增加而升高的趋势。CD62p表达平均荧光强度各组间差异不明显，仅3和7 day组间差异具有统计学意义，但仍呈上升趋势，这可能与本研究纳入的样本量较少有关。此外，3和7 day组CD41+PMPs表达率差异不明显，也可能与样本量较少有关。后期研究将扩大样本量。

图4 不同存储时间血小板的CD41+血小板微粒表达率和绝对计数变化趋势

表4 Pearson双变量相关分析结果

导致血小板活化的原因很多，保存过程中生化指标的变化[17]、采集过程因素和个体差异[18]、储存温度[19]、血小板自身活化等，本研究分析捐献者个体差异、采集因素对血小板采集后最初活化状态的影响，发现CD62p表达率与各变量无明显相关，CD41+PMPs数量分别与捐献者脉搏和白细胞数呈正相关，表明血小板离体后的活化状态与捐献者的自身生理条件差异存在一定关系。此外，Pearson双变量相关分析显示，CD62p表达率与CD41+PMPs表达率和数量均正相关，说明单采血小板体外存储过程中的活化很可能是导致CD41+PMPs表达增加的重要因素。存储7 day组的血小板CD41+PMPs数量较其他各组增加尤为明显，呈几十倍。从流式结果图上看，该组本底颗粒明显增多，且CD41+PMPs表达率并未呈几十倍增加，由此可见，造成这一结果的原因除血小板活化外，血小板的凋亡或破裂可能也是重要因素。具体机制依赖后续研究。

图5 CD62p表达率与CD41+PMPs表达率和计数的相关性分析

由于血小板保存期短，易被激活，所以血小板制备、保存问题备受关注。另一方面，体外血小板活化状态直接关系患者的临床输注效果，临床血小板应用对象主要是外科及内科患者，其中，外科患者的输血主要目的是快速止血，要求输注的血小板即刻发挥作用，但内科患者输注主要目的是以预防出血为主，要求血小板具有较长体内存活期，因此，了解血小板存储期间活化特点能为不同治疗目的的输注方案提供参考依据。本研究发现，保存4天内的血小板活化无明显差异。说明目前5天保存期的血小板在内外科单纯止血目的的输注中均较适合。近年来，关于PMPs与疾病关系的研究越来越多，其在不同的疾病中发挥不同作用。一些心血管疾病、肿瘤以及自身免疫疾病中均检测到PMPs含量的增高，如：ITP[20]、糖尿病[21]、口腔癌[22]、房颤射频消融术后[23]，在这些疾病中，其可以作为一种病理因子。但在Castman综合征和Scott综合征[24-25]中PMPs质量和数量的变少使得患者具出血倾向。随着个性化治疗观念日益加强，输注血小板不应只以止血为单一目的。有研究发现[26]，可通过离心方法直接获取存储9天的浓缩血小板释放的PMPs，所获得的PMPs表面保留了与止血功能相关的糖蛋白和PS，表现出止血功能。本研究发现，存储7天的血小板会产生大量PMPs，单采PMPs是否具有同样的生物活性，以及能否被有效获取，并得到合理保存运用，将是开发血小板相关产品储存新方式，延长保存期限的重要的研究方向。

血小板是极其宝贵的资源，合理、有效的利用是重要的课题，后续研究将会更全面评价血小板存储过程中的功能变化指标，为血小板的有效采集和应用提供一定的参考。

参考文献:

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