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补阳还五汤对脑缺血大鼠神经元自噬及损伤修复的影响

2025-02-28 88 上传者：管理员

摘要：目的通过观察补阳还五汤对大鼠神经元自噬及损伤修复的影响，探讨其对脑缺血的调控机制。方法构建大鼠大脑中动脉栓塞模型，采用高、中、低3种剂量的补阳还五汤进行干预。电镜下观察大鼠神经元自噬情况，同时免疫组化检测自噬相关蛋白LAMP2、GFAP、SYN的表达。结果各组均可见到自噬趋势，其中模型组自噬趋势明显。随着治疗量的增加，溶酶体和自噬现象逐渐减少。模型组中LAMP2、SYN低表达、GFAP高表达，随着治疗量的增加，LAMP2、SYN表达增加，而GFAP表达下降。其中高剂量组中，LAMP2、SYN表达明显增加，GFAP明显减低，和模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论补阳还五汤改善脑缺血后的神经功能有一定的剂量依赖性，其可能通过调控过度自噬、减少有害物质损害、增强神经细胞和效应细胞之间的突触联系等机制促进受损神经细胞的修复。

关键词：
大鼠
溶酶体
神经修复
脑缺血
补阳还五汤
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自噬作为一种高级别的生命现象,目前广泛存在于自然界的真核细胞中｡近年来不少研究证实,自噬不仅参与了脑缺血的发生发展,而且在脑缺血损伤后的恢复进程中还起着重要的作用｡但自噬激活后其在脑缺血损伤恢复中的作用机制还有待商榷[1]｡补阳还五汤出自清代王清任《医林改错》,在临床广泛地应用于治疗脑缺血患者｡现代研究表明,补阳还五汤可通过提高新生神经元的数量达到促进神经损伤修复的作用[2-4]｡课题组前期研究表明,补阳还五汤可以调节脑缺血大鼠自噬相关蛋白⁃溶酶体相关膜蛋白2(LysosomalAssociatedMembranceProtein2,LAMP2)的表达[5]｡为进一步研究补阳还五汤对自噬的调控机制及其对神经修复的影响,本课题组构建了大鼠大脑中动脉栓塞模型,运用补阳还五汤灌胃治疗,通过观察神经元细胞的自噬情况,以及胶质纤维酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein,GFAP)､突触素(Synapto⁃physin,SYN)的表达,探讨补阳还五汤对神经元细胞自噬调节以及对神经损伤修复的作用机制｡

1、资料与方法

1.1实验动物雄性成年Wistar大鼠,健康清洁级,50只,体质量为100~150g,购自福建中医药大学动物实验中心[许可证编号:SYXK(闽)2023⁃0004]｡

1.2实验药物中药均购置北京康仁堂药业公司｡包含黄芪120g,当归尾6g,赤芍4.5g,地龙､川芎､桃仁､红花各3g｡饮片质量标准参照《中华人民共和国药典》[6],按《中药药理研究方法学》[7]制备补阳还五汤水煎液,由福建省康复医院中药煎药室制成水煎浓缩剂,使生药浓度分别为1g/ml｡

1.3试剂及仪器GFAP兔多抗(货号:16825⁃1⁃AP)､synaptophysin兔多抗(货号:17785⁃1⁃AP);LAMP2兔多抗(货号:BM4357)､即用型SABC⁃POD(兔IgG)试剂盒(货号:BM4357)均购自美国PTG公司,透射电子显微镜HITACHI(奥林巴斯)｡

1.4方法及步骤

1.4.1造模方法采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型｡大鼠麻醉后,首先分离颈总动脉(CCA)与迷走神经;然后结扎颈动脉,结扎处位于颈动脉分叉处约5mm｡然后结扎颈外动脉,同时阻断颈内动脉血流,最后在颈总动脉结扎处将用制备好的栓线从颈总动脉插入颈内动脉,并阻断颈内动脉,接着沿着颈内动脉推进栓线,到达大脑动脉起始处后立即扎紧颈总动脉,最后缝合切口｡注意操作过程中遇到阻力不要使用蛮力｡

1.4.2实验分组根据研究需求,随机分成5组,每组10只｡假手术组(不进行干预)､模型组(只造模,不干预)､补阳还五汤低剂量组[造模后,采用常规剂量,2.5g/(kg·只)干预]､低剂量组[造模后,采用2剂量,5.0g/(kg·只)干预]､高剂量组[造模后,采用10剂量,25g/(kg·只)干预]｡假手术组､模型组均使用0.9%NaCl生理盐水灌胃,中药组大鼠每天灌胃1次｡所有大鼠均造模前灌胃7d,造模后继续灌胃7d｡每组随机抽取大鼠5只,取新鲜脑组织,切割成1mm3的小组织块,EP管固定｡经漂洗⁃脱水⁃包埋⁃切片⁃染色,制成铜网切片,透射电子显微镜下观察,采集图像分析｡

1.5观察指标对LAMP2､GFAP､SYN蛋白进行免疫组化检测,取新鲜大鼠脑皮质固定,石蜡包埋,5μm连续切片,采用免疫组织化学染色法检测LAMP2､GFAP､SYN｡显微镜下随机选择5个非重叠视野(×200),观察LAMP2､GFAP､SYN表达并计算阳性细胞数占总细胞数百分比｡稀释比例:兔抗大鼠LAMP2一抗1∶100,兔抗大鼠GFAP一抗1∶200,兔抗大鼠GFAP一抗1∶200｡

1.6统计学方法采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析,计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析｡以P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1透射电镜结果电镜结果显示,假手术组的神经元细胞核膜完整,染色质结构正常,可见线粒体､内质网,未见自噬现象及自噬体;模型组的初级溶酶体､次级溶酶体较多,高尔基体扁平囊部分扩张,粗面内质网扩张,可见自噬趋势;低剂量组可见线粒体肿胀,神经细胞老化,有较多初级､次级溶酶体,可见自噬现象;中剂量组可见少量次级溶酶体,偶可见自噬体及自噬现象;高剂量组可见少量溶酶体,未见自噬体及自噬现象｡见图1｡

图1透射电镜结果(×5000倍及×20000倍)

2.2LAMP2免疫组化结果LAMP2标记阳性细胞广泛地存于细胞胞浆中,细胞形态不规则｡LAMP2表达采用阳性细胞数占总细胞数百分比｡阳性结果判断标准为细胞包膜边缘呈棕黄色或棕褐色｡本研究中LAMP2标记阳性细胞在假手术组中的表达明显高于低剂量､中剂量､高剂量以及模型组｡模型组中表达最低,和假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡补阳还五汤低剂量组LAMP2标记阳性细胞未见明显增加,和模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)｡中､高剂量组中LAMP2标记阳性细胞表达明显增加,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡中剂量组､高剂量组与模型组､低剂量组比较,差异均有统计学意义(F值=93.359,P<0.05)｡见表1,图2｡

图2LAMP2免疫组化结果(×200倍)

2.3GFAP免疫组化结果GFAP表达采用阳性细胞数占总细胞数百分比｡GFAP标记阳性细胞存在于胞浆及星状突起纤维,包膜边缘呈棕黄色或棕褐色,在不同组中均可见到数量不均的GFAP标记阳性细胞｡结果显示,GFAP在假手术组中表达较少,模型组大鼠在脑缺血后GFAP数量有明显增加,和假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡经补阳还五汤低剂量､中剂量治疗后,GFAP表达开始缓慢下降,但和模型组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)｡经补阳还五汤高剂量组治疗后,GFAP表达明显下降,与低剂量､中剂量､模型组比较,差异有统计学意义(F值=118.567,P<0.05)｡见表1,图3｡

图3GFAP免疫组化结果(×200倍)

2.4SYN免疫组化结果SYN表达采用阳性细胞数占总细胞数百分比｡结果显示,各组大鼠皮质均可见呈棕黄色或棕褐色的SYN阳性标记细胞的表达｡在胞浆中,SYN阳性细胞包膜染成棕黄色或棕褐色,细胞形态不规则｡与假手术组比较,模型组大鼠SYN表达减少(P<0.05)｡补阳还五汤治疗后,SYN表达开始逐渐增加｡但低剂量组SYN表达和模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)｡中､高剂量组中SYN表达与低剂量组､模型组比较,差异有统计学意义(F值=83.100,P<0.05)｡见表1,图4｡

图4SYN免疫组化结果(×200倍)

表1各组大鼠LAMP2GFAPSYN表达比较

3、讨论

自噬作为一种生命现象,近年来不少研究认为其可能参与脑缺血损伤的病理过程,同时其可能在损伤修复方面起着重要作用｡因此,自噬在脑缺血中的作用机制可能存在损伤和防御的双向调节｡至于其是正向调节还是负向调节,很大程度取决于自噬靶向细胞内底物的负荷能力与细胞自噬能力之间的平衡｡

研究认为,当细胞缺乏营养或处于应激状态时,激活自噬,通过选择性地降解受损的线粒体､功能失调的蛋白､过量的过氧化物酶体等获得营养和能量,达到维持组织内环境稳态的作用[8]｡但是过度的自噬反而会促进神经细胞的凋亡和神经元的死亡[9,10]｡本研究中,模型组大鼠LAMP2蛋白表达较假手术组下降,同时电镜下观察到模型组内初级溶酶体､次级溶酶体较假手术组增多,高尔基体扁平囊部分扩张,粗面内质网扩张,自噬趋势明显｡随着治疗剂量的增加,LAMP2蛋白表达逐渐增多,电镜下线粒体肿胀,神经细胞老化,初级､次级溶酶体等自噬现象逐渐减少｡高剂量组LAMP2表达最多,与模型组､低剂量组比较,差异均有统计学意义,同时电镜下观察到溶酶体较少,未见明显的自噬体及自噬现象,提示高剂量补阳还五汤可通过上调LAMP2蛋白表达,去激活某些自噬防御途径,抑制脑缺血后神经元细胞的过度自噬,对脑缺血后神经元细胞起到保护作用｡

GFAP是星形胶质细胞活化状态的标志物｡该细胞在生理状态下表达较少,而在各种病理状态下则会反应性上调[11]｡研究表明,在脑缺血后,GFAP会被各种因素激活｡其激活后通过释放各种炎症因子,造成神经元的损伤,影响神经元轴突的再生[12]｡本研究中大鼠GFAP在假手术组中表达较低,造模后,GFAP标记阳性细胞数目明显较多,染色明显增强,胞体较肥大,提示脑缺血后GFAP表达呈明显上升趋势｡随着补阳还五汤治疗剂量的增加,GFAP的表达逐渐降低,其中高剂量组GFAP标记阳性细胞数下降明显,随着治疗量的增加,GFAP的表达逐渐降低,低剂量､中剂量组中GFAP下降不明显｡高剂量组GFAP标记阳性细胞数下降明显,与模型组比较差异有显著统计学意义,说明GFAP的表达具有剂量依赖性｡补阳还五汤通过抑制GFAP的表达,减少炎症介质的释放,减少脑缺血的神经损害,达到神经保护作用[13]｡

SYN是一种糖蛋白,特异性分布于神经突触前囊泡膜上,与机体神经的生长､修复､再生和突触重塑密切相关[14]｡研究表明,在脑缺血时突触素的表达可发生明显降低[15],因此SYN也可作为神经元再生和修复的重要标志物｡本研究中,SYN在正常大鼠的脑组织中广泛的表达｡造模成功后,SYN表达开始出现明显下降,其可能是脑缺血后,一部分神经细胞死亡,神经细胞之间相应的突触联系减少所致｡随着补阳还五汤治疗剂量增加,SYN的表达逐渐增多｡其中高剂量组增多明显,与低剂量组和模型组比较,差异均有统计学意义,提示补阳还五汤可通过上调SYN蛋白的表达激活某些信号通路,促进突触的形成和再生,恢复神经元与神经元､神经元和效应细胞之间的信息传递,达到改善脑缺血后神经功能｡

补阳还五汤在改善脑缺血方面的作用有综合性和多面性:①补阳还五汤可通过上调自噬相关蛋白LAMP2的表达,调控脑缺血后神经元细胞的过度自噬,保护神经元的过度受损;②补阳还五汤可通过抑制GFAP蛋白的表达,减少有害物质的释放,缓解脑缺血后的神经损伤;③补阳还五汤可通过调控SYN蛋白的表达促进神经突触的再生,帮助恢复神经元细胞之间的联系｡然而,本实验还有很多需要进一步研究的问题｡首先,自噬是由多因子多因素共同调控的现象,对缺血后损伤的神经细胞有正向调节和负向调节,LAMP2是其中一个影响因子,补阳还五汤具体通过什么信号传导通道发挥作用还需要研究探讨｡此外,本实验中补阳还五汤对神经细胞的修复作用存在一定的剂量依赖性,高浓度的效果明显｡补阳还五汤对神经细胞的修复是否存在时间依赖性,不同浓度作用的时间差异对神经细胞修复有何影响尚待进一步研究｡

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