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氧化苦参碱长循环纳米粒的制备及体外释药特性研究

2025-03-18 102 上传者：管理员

摘要：目的制备包载氧化苦参碱的长循环纳米粒，并研究其体外释药行为。方法采用W/O/W乳化溶剂蒸发法制备包裹氧化苦参碱的长循环纳米粒，并对纳米粒的外观、粒径、电位、载药量与包封率等质量指标进行考察，通过透析袋法研究纳米粒的体外释药行为，并进行动力学模型拟合。结果包载氧化苦参碱的长循环纳米粒溶液外观泛有淡蓝色乳光，粒径为（85.67±2.47）nm,电位为（-20.725±2.5）mv,载药量平均值为21.09%,包封率平均值为74.39%,在24h内药物体外释放率为80.27%,对其体外释药曲线进行方程拟合，氧化苦参碱长循环纳米粒释药行为符合Ritger-Peppas方程，其拟合方程为M_t=32.1056(t0.30518),R2=0.93235。结论制备的氧化苦参碱长循环纳米粒粒径分布均匀，具有较好的稳定性，并能缓慢释放药物。

关键词：
DCM
PEG-PLLA
体外释放
氧化苦参碱
纳米粒
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不采取及时有效的干预措施,预计到2030年,DM患者总数将增加到6.43亿,而至2045年,这一数字将增加到7.83亿[1]｡糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)作为糖尿病的一种重要并发症,其概念最早于1974年由Riff等[2]提出｡当前,针对DCM尚缺乏特效治疗手段,存在靶点不明确､疗效不显著及有副作用等局限性问题[3]｡在中医领域,DCM的病因病机复杂,涉及阴虚､气虚､痰浊､瘀血､热邪等多种因素的相互作用,这些因素共同推动了疾病的恶化[4]｡近些年,随着对DCM病因病机的深入研究,中医提出了包括益气养阴､健脾补肾､祛痰化瘀､活血通络等多种治疗方法｡在临床上,益气药､滋阴药､活血化瘀药及清热药等类别药物被广泛应用,成为治疗DCM的重要手段｡

苦参作为一种常用的中草药,以其清热燥湿,化瘀散结等功效而闻名,广泛应用于湿疹热痢,皮肤骚扰等疾病的治疗中[5]｡其中,氧化苦参碱作为苦参的关键活性成分,展现出多样的生物活性,并在多种疾病的治疗中取得了良好的效果,包括缺血性脑卒中､癌症､心脑血管疾病及糖尿病等｡在临床上,氧化苦参碱常被用于抗炎､抗过敏､抗病毒､抗纤维化等方面,同时能有效抑制心肌肥大和纤维化发生发展[6]｡

氧化苦参碱作为一种高度亲水性的弱碱性药物[7],因其难以透过生物膜屏障,导致口服后的生物利用度相对较差｡在体内,氧化苦参碱能代谢为苦参碱,但其半衰期很短,仅为2~2.5h[8],普通制剂需频繁给药,不仅血药浓度波动大,还可能引起恶心､呕吐等不良反应｡纳米粒是一种介于10~1000nm的粒径新型药物递送系统[9],可增加药物溶解度､增强稳定性及提高生物利用度,实现缓释给药,降低药物毒副作用｡汪家鼎等[10]制备了PEG/PLGA复合纳米粒,并通过体外细胞实验和活体动物成像实验验证,PEG的修饰能够有效减缓PLGA纳米粒在血液中的清除速度,促进其体内长循环[11-12]｡

本文以PEG-PLLA为载体材料,氧化苦参碱为药物,采用W/O/W乳化溶剂蒸发法,构建氧化苦参碱的给药系统,并对制备的氧化苦参碱长循环纳米粒的形态､粒径､载药量与包封率进行评价,通过透析袋法考察氧化苦参碱长循环纳米粒的体外释药行为｡该研究将为氧化苦参碱缓释制剂提供前期理论基础,通过细胞实验和动物实验考察氧化苦参碱长循环纳米粒的生物相容性及对糖尿病大鼠心肌的影响研究做准备｡

1、材料与方法

1.1试剂与仪器

1.1.1试剂

丙交酯(纯度>98%,济南岱罡生物有限公司);辛酸亚锡(纯度>95%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);PEG6000(化学纯,阿拉丁生化科技股份有限公司);氧化苦参碱(纯度≥98%,阿拉丁生化科技股份有限公司);乙醚(国药集团化学试剂有限公司);三氯甲烷(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);司盘80(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);SDS溶液(纯度1%,实验室自制);PBS溶液(pH7.4,自制)｡

1.1.2仪器

FA224电子分析天平(上海舜宇恒平仪器);JY92-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Zetasizer/NanoZS90激光粒度仪(英国马尔文公司);CARY60UV-Vis紫外分光光度计(安捷伦科技有限公司);ZD-85恒温振荡器(国药集团化学试剂有限公司);H1850高速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);3KD超滤管(Millipore);透析袋(分子量8000-14000)(国药集团化学试剂有限公司);水相针式过滤器(13×0.45μm,上海楚定分析仪器有限公司);BrukerAvance-400核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克);PerkinElmerFTIR红外光谱仪(上海珀金埃尔默股份有限公司);X射线衍射仪(日本岛津)｡

1.2方法

1.2.1聚合物PEG-PLLA的合成及表征

取丙交酯(重结晶3次)､辛酸亚锡和PEG6000(其物质量之比为100∶1∶1),置于50mL双口烧瓶中,抽真空充氮气各3次,然后在120℃的条件下反应2h｡反应结束后,三氯甲烷溶解产物,溶液沉淀于冷乙醚中｡收集沉淀物,并在真空条件下干燥24h｡

核磁共振氢谱(1H-NMR):采用BrukerAvance-400核磁谱仪对样品PEG-PLLA进行核磁共振测定｡将样品用氘代氯仿(CDCl3)溶解,以四甲基硅烷(TMS)为内标,采用400MHz共振频率进行测定｡

傅里叶变换红外光谱(FTIR):用PerkinElmerFTIR分光光度计对样品进行红外光谱分析｡采用溴化钾(KBr)压片法对PEG-PLLA进行压片处理,在4000~500cm-1波数范围内扫描分析｡

X射线衍射(XRD):用X射线衍射仪(XRD6100)对PEG-PLLA进行扫描分析其结晶性能｡相关操作步骤及测定条件为:将样品倒入样品池,压平后,放入样品座中进行检测,管电压为40KV,管电流为30mA;扫描范围:5°~100°;扫描速度:10℃/min;扫描步长:0.1°｡

1.2.2氧化苦参碱纳米粒的制备

采用乳化-溶剂蒸发法制备氧化苦参碱纳米粒(OMT/NPs)｡先称取约0.0500g的载体材料(PEG-PLLA)溶于1mL的三氯甲烷(CHCl3)中,再称取0.0200g的氧化苦参碱溶于0.5mL的蒸馏水中,将两种溶液混合后加入适量司盘80,移液枪吹打混匀,然后加入1%SDS溶液5mL,用超声细胞破碎仪(功率为35%,时间为5min)超声2次｡最后,常温下缓慢搅拌24h即可｡

1.2.3氧化苦参碱标准曲线的绘制

采用紫外分光光度法(UV法)测定药物含量｡精确称量0.0150g氧化苦参碱,将其配成0.3mg/mL的氧化苦参碱对照品｡准确量取0.2､0.3､0.4､0.6､0.7mL母液分别加入10mL容量瓶中,蒸馏水稀释定容,得到0.006､0.009､0.012､0.018､0.021mg/mL样品｡蒸馏水作空白对照调零,200~800nm波长扫谱｡以氧化苦参碱溶液的浓度为横坐标,对应的吸光度值作为纵坐标,绘制标准曲线｡基于所得数据,计算并得出回归方程,用于后续的药物含量测定｡

1.2.4包封率､载药量的测定

采用UV法测定纳米粒的包封率与载药量｡用移液枪取1000μL氧化苦参碱纳米粒溶液,加入超滤管内管(截留分子量8000~14000)中,将超滤管放入离心机,10000rpm离心2次,每次10min,收集超滤管外滤液,用蒸馏水稀释滤液至10mL,测定其吸光度,通过氧化苦参碱浓度的吸光度标准曲线算出浓度,得到未包入纳米粒中的药物量,从而计算纳米粒中药物含量,以上结果重复3次,取平均值｡根据以下公式得到氧化苦参碱纳米粒的包封率和载药量｡

1.2.5氧化苦参碱纳米粒体外释放实验

取2mL预先制备好的纳米粒溶液于透析袋中,两头用夹子夹紧,将透析袋放入装有100mLPBS溶液(pH7.4)的锥形瓶中,使释放介质覆盖透析袋,然后,将锥形瓶放入恒温振荡器中,在(37.0±0.5)℃,振荡速度100r/min条件下恒温振荡,分别于0.5､1､2､4､8､12､24h取样3mL,取液后立即补加3mL的PBS溶液｡样品由滤膜(13mm×0.45μm)滤过,得续滤液,通过氧化苦参碱浓度的吸光度标准曲线,计算氧化苦参碱含量,计算累积释药率Q(%)｡

2、结果

2.1聚合物PEG-PLLA的性质

PEG-PLLA的核磁氢谱如图1(A)所示,-PLLA链段上的-CH3的化学位移在1.5ppm,而-CH的化学位移在5.2ppm,PEG链段上的亚甲基的化学位移在3.6ppm｡红外图谱如图1(B)所示,2998cm-1,2875cm-1出现的峰分别是-CH3和CH2的伸缩振动峰,1765cm-1是羰基的伸缩振动峰｡XRD图谱如图1(C)所示,在2θ=17.9°,19.2°和22.5°时出现了特征峰｡基于上述数据,可以确认PEG-PLLA聚合物合成成功｡

图1聚合物PEG-PLLA的表征

2.2氧化苦参碱纳米粒的制备结果

制备得到的纳米粒溶液有较明显的蓝色乳光(图2A);其粒径为(85.67±2.47)nm,电位为(-20.725±2.5)mv,PDI为0.280(图2B),粒径跨度小,纳米粒外观呈球形结构(图2C),同时记录15d的粒径和电位变化,结果显示二者变化不明显(图2D),且无分层､沉淀等现象,表明纳米粒能在15d内稳定储存｡

图2氧化苦参碱纳米粒的理化

2.3氧化苦参碱纳米粒体外分析方法的建立采用

1.2.3的检测方法进行分析,测定不同浓度的氧化苦参碱的吸光度,发现波长为205nm时氧化苦参碱有吸收峰｡对吸光度和氧化苦参碱的浓度(mg/mL)进行线性回归分析,得到回归方程:y=32.15x+0.1021,R2=0.9991,说明氧化苦参碱在0.006~0.021mg/mL范围内线性关系良好｡标准曲线如下图3所示｡

图3紫外可见光法测定氧化苦参碱的标准曲线图

2.4氧化苦参碱纳米粒载药量与包封率

实验过程中,取三批样品A､B､C,分别放入离心管,通过紫外分光光度法测量数据,计算A批样品的包封率为71.72%,载药量为20.49%,B批样品的包封率为77.78%,载药量为22.22%,C批样品的包封率为73.67%,载药量为20.56%｡将其结果取平均值,计算氧化苦参碱纳米粒的包封率为74.39%,载药量为21.09%,结果见表1｡

表1三批样品A､B和C的载药量和包封率数据

2.5药物体外释放曲线氧化苦参碱纳米粒的体外释放特性呈现出一个初始较快的释放阶段,但在0.5h内,药物累积释放量未超过30%,表明无明显的突释效应｡随后,药物释放趋于平稳,直至24h,氧化苦参碱纳米粒中的药物累积释放量达到80.27%｡为了深入地理解其释放机制,将体外释放曲线与零级方程､一级方程､Higuchi方程及Ritger-Peppas方程进行了拟合,结果如图4和表2所示｡根据表2中的拟合结果,Ritger-Peppas方程的相关系数最高｡因此,可以认为该纳米粒的药物释放规律最符合Ritger-Peppas方程｡

图4纳米粒的体外释放曲线

表2药物体外释放曲线的方程拟合结果

3、讨论

Wang等人[13]研究显示,氧化苦参碱对心肺复苏术后大鼠心肌重塑有显著的抑制作用,能明显减轻心肌组织重构与纤维化程度,对损伤后心肌细胞具有保护作用,进而有助于预防心脏衰竭的发生｡此外,氧化苦参碱毒性低,不良反应少,这使得其在治疗糖尿病心肌病方面展现出广阔的应用前景｡

本文以PEG-PLLA为载体材料,氧化苦参碱为目标药物,采用W/O/W乳化溶剂蒸发法,构建氧化苦参碱的纳米粒给药体系｡最终制得的氧化苦参碱纳米粒外观呈淡蓝色乳光,稳定性好,纳米粒的载药量为21.09%,包封率为74.39%｡

氧化苦参碱长循环纳米粒的药物含量通过紫外分光光度仪进行了测定,结果显示,其线性关系符合要求｡采用透析袋法评价了该纳米粒在体外的释放特性,实验发现,在0.5h内,氧化苦参碱长循环纳米粒的释放量未超过30%,表明无突释现象,至24h,药物的累积释放量达到了80.27%,这一结果有力地证明了氧化苦参碱长循环纳米粒具备缓慢释放药物的能力｡最后,通过对体外释放曲线进行拟合分析,氧化苦参碱长循环纳米粒的药物释放行为遵循Ritger-Peppas方程,其释放过程与Fick扩散机制相吻合,这一发现有力证明了该纳米粒体系具备良好的缓释性能｡

本文目前仅限于探讨氧化苦参碱长循环纳米粒的制备及其体外药物释放特性｡未来的研究中,我们将进一步探索该纳米粒对细胞的毒性效应,并考察其在动物体内的药动学特性,旨在明确纳米化技术是否能有效增强氧化苦参碱的生物利用度｡

参考文献:

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基金资助:糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室糖尿病专项基金(2023TNB05);湖北省大学生创新创业训练计划项目(S202310927018);

文章来源:曾子容,丁洁琼.氧化苦参碱长循环纳米粒的制备及体外释药特性研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2025,39(02):93-97.