支气管哮喘(bronchialasthma,BA)是一种慢性过敏性气道炎症性疾病,其主要症状为呼吸急促､喘息､胸闷和咳嗽等[1],为主要的公共卫生和医疗保健问题之一｡桑色素(morinhydrate,Morin)是一种桑科植物中分离出的黄酮醇,具有清除自由基､抗氧化､抗炎和保肝作用[2],通过调节信号通路展示其药理活性,例如活化B细胞的核因子kappaB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号通路和Kelch样ECH相关蛋白1/核红细胞相关因子2(kelch-likeECH-associatedprotein1nuclearrespiratotyfactor2,Keap1/Nrf2)信号通路[3]｡有研究[4]表明,Morin生物/药理特性广泛,且细胞毒性低,通过调节氧化应激反应减轻卵清蛋白诱导的气道炎症｡Nrf2作为调控抗氧化应激的一种关键转录因子,在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用[5]｡血红素加氧酶-1(hemeoxygenase1,HO1)主要催化血红素分解代谢成胆绿素､Fe2+和CO,是一种重要的抗氧化酶[6]｡Nrf2/HO-1信号通路作为氧化应激反应中重要的信号通路,参与抗炎､抗氧化､细胞凋亡等过程[7],然而Morin对BA的治疗及对Nrf2/HO-1信号通路的调控尚不明确,因此本研究将基于Nrf2/HO-1信号通路探究Morin对BA小鼠炎症反应的影响及其机制｡

1、材料与方法

1.1动物

雄性BALB/c小鼠,体重18~21g,6周龄,购自山东艾茂达康生命科学有限公司[许可证号SCXK(鲁)20230010]｡小鼠在食物水源充足的SPF级实验动物房适应性饲养1周进行实验,本研究经青海红十字医院伦理委员会审批通过(Q2023-05)｡

1.2试剂

氢氧化铝[Al(OH)3]､卵清蛋白(ovalbumin,OVA)､过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司;Morin(HPLC≥98%)和鸦胆子苦醇(brusatol,Nrf2通路抑制剂,HPLC≥98%)购于上海源叶生物科技有限公司;免疫球蛋白E(immunoglobuline,IgE)､肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)､干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)､白细胞介素(interleukin,IL)-4和IL-13的酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbnentassay,ELISA)试剂盒购于上海佰朋生物科技有限公司;CD4-FITC､IL-17A-PE抗体购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;Diff-Quik染色液､苏木精伊红(HE)染液购于上海翌圣生物有限公司;检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(totalantioxidantcapacity,TAC)浓度试剂盒购于上海碧云天生物技术股份有限公司;C-kit､诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesythase,iNOS)抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司;Nrf2､HO-1抗体购于艾比玛特医药科技(上海)有限公司;β-actin抗体､二抗(山羊抗兔/抗鼠)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司｡

1.3模型建立与分组给药

75只小鼠通过腹腔注射OVA/Al(OH)3悬液以诱导BA模型[8]｡将OVA溶解在生理盐水中(浓度为200mg/L),然后按1∶1的比例与Al(OH)3(10g/L)混合均匀,分别在第1､2､3､11天,给小鼠腹腔注射0.2mLOVA/Al(OH)3悬液｡在第20､21､22天,吸入2%异氟烷(0.41mL/min)麻醉小鼠,然后将浓度为1%的OVA溶液溶于生理盐水,注入其双侧鼻腔开口处,建立BA小鼠模型｡第23天开始给予药物治疗,灌胃体积0.5mL,持续14d｡小鼠分为模型组(生理盐水)､Morin低剂量组(30mg/kg,Morin-30)､Morin中剂量组(90mg/kg,Morin-90)､Morin高剂量组(180mg/kg,Morin-180)､Morin-180+brusatol(180mg/kgMorin+4mg/kgbrusatol)组,每组15只｡另取15只小鼠设为对照组,在第1､2､3､11天腹腔注射等量生理盐水,第20天起以等量生理盐水滴鼻,与模型组同时间用等体积生理盐水灌胃｡

1.4样本收集

治疗结束后采集小鼠血样,并注射150mg/kg戊巴比妥钠处死,用生理盐水冲洗小鼠肺部,清洗气管和气管分叉处,并收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)｡将左肺上叶在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline,PBS)中匀浆并保存于-80℃冰箱;右肺上叶保存在10%中性缓冲福尔马林溶液中｡

1.5ELISA测定

将血样和BALF样品在4℃条件下以转速1000r/min(离心半径15cm)离心15min,取上清液,根据ELISA试剂盒说明书,测量血清中IgE水平及BALF中4种炎症因子(TNF-α､IFN-γ､IL-4和IL-13)水平｡

1.6血液中Th17/Treg值检测

裂解血样中的红细胞,使用预冷的PBS洗涤2次后重悬,并将红细胞密度调整为1×109个/L｡取1mL细胞悬液,加入CD4-FITC(标记Treg细胞)､IL-17A-PE抗体(标记Th17细胞),混匀后4℃避光孵育20min,以转速2000r/min(离心半径10cm)离心5min,重悬后混匀,使用流式细胞仪检测细胞Th17､Treg水平并计算Th17/Treg值｡

1.7Diff-Quik染色与计数

BALF沉淀重悬于100mLPBS中,用Diff-Quik染色液或牛鲍氏(Neubauer)计数板进行细胞学检查｡重悬液涂至载玻片并充分干燥,放入固定液中固定10~20s,甩掉多余液体;将玻片放入染色液Ⅰ中染色5~10s,随后放入染色液Ⅱ中染色5~10s,中间上下提动玻片使染液均匀分布,甩掉多余液体;将染色好的玻片放入蒸馏水中吸去多余染液;无水乙醇快速脱水3次,自然晾干､透明､封片､镜检｡

1.8测定肺组织内的氧化应激因子

取肺组织匀浆液,3000r/min,离心半径10cm,离心5min,根据相应的比色法试剂盒说明书测定上清液中TAC､MDA浓度及CAT､SOD活性｡

1.9HE和免疫组织化学法染色

对固定后的肺组织进行清洗､脱水和包埋,并制作成切片(厚度4μm),脱蜡水化后进行HE染色,显微镜下观察肺组织病理形态变化｡将脱蜡的肺组织切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH=6)中,在100°C水浴中加热10min进行抗原修复;在0.3%H2O2水溶液中孵育阻断内源性过氧化物酶;分别与C-kit(1∶500)､iNOS(1∶500)抗体室温孵育2h,再与山羊抗兔二抗(1∶1000)一起孵育;使用DAB底物试剂盒检测结合抗体;用蒸馏水洗涤后,苏木精对细胞核进行复染,封片后在显微镜下观察染色情况｡

1.10蛋白质印迹法检测

用裂解液裂解肺组织,BCA蛋白定量后,使用SDS-PAGE凝胶电泳分离25μg蛋白;将蛋白质转印至PVDF膜上,用5%脱脂牛奶封闭1h;将膜与Nrf2(1∶1000)､HO-1(1∶1000)､β-actin(1∶2000)一抗4℃孵育12h;二抗(山羊抗兔/抗鼠),按1∶5000稀释后与膜结合2h;用化学发光试剂和成像系统可视化蛋白条带,并用ImageJ2.0软件进行灰度值分析｡

1.11统计学方法

采用SPSS25.0统计软件进行数据分析｡定量资料采用(x±s)描述,组间比较采用单因素方差分析,进一步事后组间两两比较采用SNK-q检验｡检验水准α除特别说明外均设定为0.05｡

2、结果

2.1Morin对BA小鼠血液IgE和Th17/Treg值的影响

与对照组相比,模型组IgE水平和Th17/Treg值升高(P<0.05)｡与模型组相比,Morin-30组､Morin-90组､Morin-180组IgE水平和Th17/Treg值逐渐降低(P<0.05);且不同剂量Morin组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Morin-180组相比,Morin-180+brusatol组IgE水平和Th17/Treg值升高(P<0.05)(表1)｡

表16组IgE水平和Th17/Treg值比较(x±s,n=5)

2.2Morin对BA小鼠TNF-α､IFN-γ､IL-4､IL-13水平的影响

与对照组相比,模型组TNF-α､IFN-γ､IL-4､IL-13水平上升,差异有统计学意义(P<0.05)｡与模型组相比,Morin-30组､Morin-90组和Morin-180组TNF-α､IFN-γ､IL-4､IL-13水平逐渐下降(P<0.05);且不同剂量Morin组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Morin-180组相比,Morin-180+brusatol组TNF-α､IFN-γ､IL-4､IL-13水平上升,差异有统计学意义(P<0.05)(表2)｡

表26组TNF-α､IFN-γ､IL-4､IL-13水平比较(ng/L,x±s,n=5)

2.3Morin对BA小鼠BALF中白细胞的影响

与对照组相比,模型组白细胞､嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量增多(P<0.05)｡与模型组相比,Morin-30组､Morin-90组､Morin-180组白细胞､嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量逐渐减少(P<0.05);且不同剂量Morin组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Morin-180组相比,Morin-180+brusatol组白细胞､嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量增加(P<0.05)(表3)｡

表36组白细胞数量比较(×106个/L,x±s,n=5)

2.4Morin对BA小鼠肺组织氧化应激因子的影响

与对照组相比,模型组TAC､CAT和SOD浓度降低(P<0.05),MDA浓度升高(P<0.05)｡与模型组相比,Morin-30组､Morin-90组､Morin-180组TAC､CAT和SOD浓度上升(P<0.05),MDA浓度下降(P<0.05);且不同剂量Morin组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Morin-180组相比,Morin-180+brusatol组TAC､CAT和SOD浓度降低(P<0.05),MDA浓度升高(P<0.05)(表4)｡

表46组TAC､CAT､SOD和MDA浓度比较(x±s,n=5)

2.5Morin对BA小鼠肺组织病理的影响

对照组小鼠肺组织结构正常,血管周围有少量C-kit阳性细胞,支气管黏膜内iNOS阳性细胞表达少;与对照组相比,模型组小鼠肺组织显示气道阻塞明显,支气管和血管周围炎性细胞浸润,C-kit､iNOS阳性细胞增多(P<0.05),病变扩展到肺泡间隙｡与模型组相比,Morin-30组､Morin-90组､Morin-180组小鼠肺组织支气管及其周围炎症细胞和C-kit､iNOS阳性细胞减少(P<0.05);且不同剂量Morin组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Morin-180组小鼠相比,Morin-180+brusatol组肺组织损伤严重,炎症反应明显,C-kit､iNOS阳性细胞增多(P<0.05)(图1､表5)｡

图16组肺组织的HE及免疫组织化学法染色图

表56组C-kit､iNOS阳性细胞率比较(%,x±s,n=5)

2.6Morin对BA小鼠肺组织Nrf2/HO-1信号通路的影响

与对照组相比,模型组Nrf2､HO-1蛋白表达降低(P<0.05)｡与模型组相比,Morin-30组､Morin-90组､Morin-180组Nrf2､HO-1蛋白表达上升(P<0.05);且不同剂量Morin组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)｡与Morin-180组相比,Morin-180+brusatol组Nrf2和HO-1蛋白表达降低(P<0.05)(表6､图2)｡

表66组Nrf2､HO-1蛋白表达比较(x±s,n=5)

图26组肺组织Nrf2､HO-1蛋白检测结果

3、讨论

BA常见于过敏性疾病中,是一种对寄生虫的免疫反应[9],其诱因包括病毒､过敏原､刺激物(烟雾)､运动和体温变化等[10]｡Morin是一种生物活性化合物,通过抑制流感病毒进入宿主细胞产生抗炎作用[11],Morin能缓解丙烯酰胺诱导的肺损伤[12],然而Morin治疗BA的报道较少,本实验通过BA小鼠模型探究Morin对OVA诱导的过敏性BA的影响及其作用机制｡

OVA是一种过敏原,由Th2细胞和嗜酸性粒细胞介导,引起炎症反应[13]｡IL-4､IL-13和IL-5由活化的Th2细胞产生,负责B细胞IgE合成､嗜酸性粒细胞活化及黏液形成;IFN-γ由分化的Th1细胞产生,影响细胞内杀死吞噬的微生物增殖[14]｡血清总IgE水平常用于检测过敏的指标,Th17/Treg值代表免疫平衡｡本研究中,模型组小鼠血清IgE水平和Th17/Treg值较对照组明显增加,Morin治疗后IgE水平和Th17/Treg值减少,肺组织中IL-4､IL-13､TNF-α和IFN-γ表达降低,表明Morin抑制Th1､Th2细胞分泌炎症因子,具有抗炎作用｡OVA暴露会破坏氧化还原平衡并损害抗氧化防御机制,产生反应性羟基自由基､脂质过氧化和细胞损伤[15]｡模型组小鼠肺部抗氧化因子(TAC､SOD､CAT)水平随着MDA的增加而明显降低,表明Morin可维持肺组织中的氧化平衡｡C-kit用于鉴定肥大细胞,iNOS用于检测肺组织的炎症反应｡本研究结果显示,模型组肺组织支气管肺炎的特征明显,肺泡腔的C-kit､iNOS阳性细胞及炎症细胞明显增加,经Morin治疗后这些细胞均减少,表明Morin可抑制OVA诱导的过敏性BA小鼠的炎症反应和氧化应激,与相关研究[16]结果相似｡

Nrf2是一种调节氧化还原稳态和抗氧化细胞反应的转录因子,可作为抗氧化的生物标志物｡IgE介导的过敏反应可触发Nrf2激活,导致保护性抗氧化酶HO-1的表达,Nrf2/HO-1信号通路在过度氧化应激下被激活,作为抵御细胞刺激的防御机制[17]｡黄酮类化合物在肺部疾病中的作用已有报道,黄芩苷通过Keap1-NRF2/HO-1信号通路调节铁蛋白自噬和巨噬细胞免疫,促进非小细胞肺癌对顺铂的敏感性[18];黄酮木脂素通过MAPK/NF-κB和Keap1/Nrf2/HO-1信号通路减弱脂多糖诱导的急性肺损伤[19];鸢尾黄素通过激活Th2介导的过敏性BA小鼠的Keap1/Nrf2/HO-1信号通路来抑制氧化应激[20]｡在本实验中,模型组小鼠Nrf2､HO-1蛋白下调,不同剂量的Morin均可激活Nrf2､HO-1的表达,其表达水平随着Morin剂量的增加呈上升趋势;然而加入brusatol后,Nrf2､HO-1蛋白表达降低,过敏小鼠的炎症因子水平和炎症细胞数量增多,表明Morin可通过激活Nrf2/HO-1信号通路来抑制BA小鼠炎症反应｡也有研究[14]表明,Morin通过抑制促炎因子IL-13表达,阻断炎症信号通路,减轻BA症状｡

综上所述,Morin可抑制BA小鼠免疫失衡､炎症反应和氧化应激,其机制与激活Nrf2/HO-1信号通路有关｡本研究仅探讨Morin对OVA诱导的过敏性BA炎症的作用,后续将进一步探究Morin对其他诱因引起的BA反应,完善其治疗效果｡

基金资助:青海省卫生健康委员会科研项目(No:2023-wjzd-11);

文章来源:杨小平,严宏,尚蓉,等.桑色素对支气管哮喘小鼠炎症反应的影响及其机制[J].成都医学院学报,2025,20(02):207-211+260.