葛根(KudzuvineRoot),又名鹿藿、黄斤、鸡齐等,是豆科(Leguminosae)葛属(Pueraria)多年生落叶藤本植物[1]。葛根具有极高的营养和药用价值,素有“南葛北参”之美誉,是我国卫生部门批准的药食两用的天然植物资源[2]。葛属共有约35种,主要分布于印度、日本、马来西亚等地。我国产8种及2变种,主要分布于西南部、中南部至东南部,长江以北少见[3]。葛根是我国传统的中药材,始载于《神农本草经》,主司发表解肌,升阳透疹,解热生津[4]。《中国药典》(2015版)收载的葛根和粉葛,为野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]或甘葛藤(PuerariathomsoniiBenth.)的干燥根[5]。葛根提取物是以葛根的干燥根为原料加工制成的具有较高活性成分的提取物。葛根的主要活性成分包括葛根素(puerarin)、大豆苷(daidzin)、大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、染料木苷(genistin)等异黄酮类化合物[6]。近年来,国内外学者对葛根中葛根素等异黄酮类的生物活性及药理功能进行了多方面的研究,发现其具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗骨质疏松[9]、降糖[10]、抗癌[11]等多种功效,在临床上主要用于心脑血管疾病、糖尿病等的治疗[12,13]。

常用的中药灭菌方法包括干热灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌和环氧乙烷气体灭菌等,这些方法各有利弊。其中,辐照是一种“冷灭菌”方法,其穿透力强,不会引起被辐照物温度的明显升高,适合挥发性、热敏性中药的大批量灭菌[14]。我国的中药辐照灭菌研究始于20世纪60年代,且发布了《60Co辐照中药灭菌剂量标准》(卫药发[1997]第38号),该标准成为中药领域60Co辐照灭菌的重要依据[15]。2015年国家食品药品监督管理总局发布了《中药辐照灭菌技术指导原则》[16],为保证中药药品质量,规范辐照技术在中药灭菌中的正确应用提供了指导。

目前用于辐照灭菌的射线类型主要有γ射线和电子束,60Co-γ射线辐照灭菌的实际应用最为广泛,电子束辐照灭菌的发展也十分迅猛。电子束和γ射线属于不同类型的射线,它们的性质及作用机制不完全相同[17]。前期中药辐照灭菌的研究主要以60Co-γ射线为主,关于电子束辐照对中药灭菌的效果以及2种辐照灭菌方式作用效果差异性的研究较少[18,19,20]。本试验以葛根提取物为材料,分别研究不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照灭菌对葛根提取物微生物限度[需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和沙门氏菌(Salmonella)]、自由基清除等抗氧化活性及指纹图谱的影响,并考察2种辐照灭菌方式效果的差异性,旨在为辐照灭菌技术,特别是电子束辐照灭菌技术在中药材及饮片中的合理应用提供理论依据和技术支持。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

葛根提取物(葛根素含量60%,长沙市惠瑞生物科技有限公司)用PE自封袋封装,每袋50g,共15份,用于微生物限度检查;每袋约100g,共27份,用于抗氧化活性测定和高效液相色谱(HPLC)指纹图谱检测。

葛根素标准对照品(含量纯度95.4%)中国食品药品检定研究院;胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基,购于广东环凯微生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),日本WAKO公司;乙腈(HPLC级),美国SIGMA公司;重铬酸银和重铬酸钾(银)剂量计,实验室自制;乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、磷酸等试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器与设备

AgilentTechnologies1260InfinityⅡ高效液相色谱仪,美国Agilent公司;SB-5200D超声波清洗仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;SQP电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SPX-250B生化培养箱,天津泰斯特仪器有限公司;MJ霉菌培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;超净工作台,苏州净化设备有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;UV-2450紫外可见分光光度计,日本岛津公司。

1.3试验方法

1.3.1辐照处理

γ射线辐照在湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所湖南辐照中心进行,放射源为60Co,放射性活度为3.14×1016Bq,采用动态方式辐照,剂量率约8.33Gy·min-1。辐照过程用经中国计量科学研究院国家剂量保证服务(NDAS)比对标定的重铬酸银和重铬酸钾(银)剂量计进行剂量跟踪。

电子束辐照在湖南湘华华大生物科技有限公司进行,功率15kW,电子束能量10MeV,剂量率约1kGy·s-1。辐照过程用经中国计量科学院标定的FWT-60剂量片进行剂量跟踪。

试验辐照剂量分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0kGy,60Co-γ射线吸收剂量实测值分别为0、2.8、5.7、8.3、10.6kGy,电子束吸收剂量实测值分别为0、2.4、5.1、7.7、10.3kGy,以上每个剂量设3个平行。样品辐照完成后立即进行各项指标检测,所有样品均重复检测3次。

1.3.2微生物限度检测

参照《中国药典》(2015版)非无菌产品微生物限度检查(通则1105):微生物计数法;非无菌产品微生物限度检查(通则1106):控制菌检查法。其中,需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数采用平皿法中的倾注法[5]。

1.3.3抗氧化活性测定

称取2.0g葛根提取物,加入80mL70%乙醇溶液,于80℃恒温水浴锅中避光浸提30min,提取液于3000r·min-1离心10min,取上清液作为葛根提取物中抗氧化成分提取液,置于4℃冰箱保存备用[21]。

1.3.3.1DPPH自由量(DPPH·)清除率测定

用无水乙醇配制0.2mmol·L-1DPPH溶液,避光保存备用。取3.0mL提取液与3.0mLDPPH溶液混合摇匀,避光放置30min,于517nm波长处测定吸光度值AX。同时,取3.0mL乙醇与3.0mLDPPH溶液混匀,避光放置30min,于517nm波长处测定吸光度值A0,以乙醇作为空白Ai。按照公式计算DPPH·清除率[22]:

DPPH⋅清除率=[1−(Ax−Ai/(A0−Ai))]×100%         (1)。DΡΡΗ⋅清除率=[1-(Ax-Ai/(A0-Ai))]×100%         (1)。

1.3.3.2羟基自由基(·OH)清除率测定

取1.0mL0.15mo1·L-1磷酸缓冲液(pH值7.4)、0.2mL520μg·mL-1番红O溶液、1.0mL6mmo1·L-1EDTANa2-Fe2+溶液混合,再加入7.0mL提取液,最后加入0.8mL6%H2O2,置于40℃水浴30min,在520nm波长处测定吸光度值A。以去离子水做空白调零(Ai),以等体积的去离子水和EDTANa2-Fe2+溶液作为对照(A0)。以0.02mg·mL-1特丁基对苯二酚(tertiarybutylhydroquinone,TBHQ)无水乙醇溶液为阳性对照[23]。按照公式计算·OH清除率:

⋅OH清除率=(A−Ai)/(A0−Ai)×100%         (2)。⋅ΟΗ清除率=(A-Ai)/(A0-Ai)×100%         (2)。

1.3.3.3总还原力测定

取1mL提取液,依次加入磷酸缓冲液(pH值6.6)和1%铁氰化钾溶液各2.5mL,混匀后置于50℃水浴20min,加入2.5mL10%三氯乙酸溶液,混匀,800r·min-1离心10min;取2.5mL上清液,再次加入蒸馏水和0.1%氯化铁溶液各2.5mL,混匀后静置10min,于700nm波长处测定吸光度值[23]。以0.01mg·mL-1TBHQ无水乙醇溶液为阳性对照。吸光度值越高,表明样品还原力越强。

1.3.4HLPC指纹图谱测定

1.3.4.1对照品溶液制备

准确称取5.47mg葛根素标准对照品,置于25mL容量瓶中,加入30%乙醇溶液制成每1mL含0.20693mg葛根素的溶液,即得对照品溶液。

1.3.4.2供试品溶液制备

准确称取0.2g葛根提取物,置于100mL具塞锥形瓶中,加入50mL30%乙醇溶液溶解,超声提取30min,残渣与提取液一起转入100mL容量瓶中,并用30%乙醇溶液少量多次清洗锥形瓶,清洗液倒入容量瓶中,加30%乙醇溶液稀释至刻度,摇匀,过滤,续滤液过0.25μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

1.3.4.3色谱分析

AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相,按照表1的程序进行梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,柱温25℃,进样量5μL,检测波长250nm[5]。

1.3.4.4指纹图谱采集

按前述方法分别制备对照品和供试品溶液,以30%乙醇溶液作为溶剂空白。精密吸取溶剂空白、对照品、供试品溶液分别进样,记录70min指纹图谱。

表1流动相时间程序

2、结果与分析

2.160Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物中微生物存活数的影响

《中国药典》2015版明确规定了中药提取物的微生物限度标准,需氧菌总数不超过103CFU·g-1,霉菌和酵母菌总数不超过102CFU·g-1[5]。由表2可知,未辐照样品(0kGy)中需氧菌总数为3.0×103CFU·g-1,霉菌和酵母菌总数为7.5×102CFU·g-1,不符合《中国药典》关于中药提取物微生物限度标准的规定。2种辐照方式均能有效抑制葛根提取物中微生物的生长,随着吸收剂量增大,抑制效果逐渐增强。60Co-γ射线和电子束辐照吸收剂量分别为5.7kGy和5.1kGy时,样品的微生物总数满足《中国药典》所规定的限度标准,吸收剂量分别为5.7kGy和7.7kGy时,样品的微生物总数均降至10CFU·g-1以下。此外,吸收剂量相近时,经60Co-γ射线辐照后样品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均低于电子束辐照样品,表明60Co-γ射线辐照对葛根提取物的灭菌能力优于电子束辐照。

2.260Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物抗氧化活性的影响

由表3可知,未辐照样品的DPPH·和·OH清除率分别达到87.41%和72.80%,经2种不同方式辐照处理的葛根提取物均对2种自由基有较强的清除效果,表现出较强的抗氧化能力和还原能力。60Co-γ射线和电子束辐照均不会对葛根提取物的DPPH·和·OH清除率产生显著影响(P>0.05)。抗氧化剂的抗氧化活性与还原能力直接相关,抗氧化剂通过发生还原作用给出电子,从而达到清除自由基的作用,还原能力越强,抗氧化活性越高。2种辐照方式也均不会对葛根提取物的总还原能力产生显著影响(P>0.05)。因此,60Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物的DPPH·清除能力、·OH清除能力和总还原能力的影响均不显著(P>0.05),2种辐照方式之间也无显著差异(P>0.05),表明60Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物的抗氧化活性不会产生显著影响。

表2不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照处理对葛根提取物微生物存活数的影响

表3不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照处理对葛根提取物抗氧化活性的影响

2.360Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物指纹图谱的影响

中药指纹图谱技术是研究中药有效成分、控制中药质量以及鉴别真伪的有效方法,已在国际上得到广泛认可。葛根素对照品指纹图谱如图1所示,其中4号峰为葛根素。在葛根提取物指纹图谱上共选择标定了11个共有特征峰,并以4号峰作为参比峰,结果见图2。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0[24]软件对不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照葛根提取物的HPLC图谱进行多点校正、自动匹配(时间窗宽度0.10),用中位数法生成对照图谱R,即共有模式图(图2),并计算相似度,5种葛根提取物特征峰的相似度达到1.0,结果见表4。以4号峰(葛根素)为参比峰,计算各处理葛根提取物的相对保留时间及相对峰面积,其中5种处理11个共有峰的相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)均小于0.5%,相对峰面积的RSD均小于1.5%(除11号峰的RSD为9.98%),结果如表5～6所示。依据上述指纹图谱检测结果可知,5种处理样品的相似度达到1.00,相对保留时间的RSD均小于0.5%,说明5个处理样品的指纹图谱无显著性差异。不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照不会对葛根提取物的指纹图谱产生显著影响(P>0.05),说明60Co-γ射线和电子束辐照均不会对葛根提取物中葛根素含量及整体化学成分一致性产生显著影响,且2种辐照方式之间也无明显差异。

图1葛根素对照品指纹图谱

图2不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照处理葛根提取物指纹图谱的共有特征峰与共有模式图

表4不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照处理对葛根提取物相似度评价结果的影响

表5不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照处理对葛根提取物指纹图谱相对保留时间的影响

表6不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照处理对葛根提取物的指纹图谱相对保留峰面积的影响

3、讨论

3.160Co-γ射线与电子束辐照对葛根提取物微生物的影响

灭菌作为影响中药及其制剂质量的关键环节,直接影响着药品的安全性、有效性及质量稳定性[18]。已有关于60Co-γ射线辐照葛根的灭菌研究[25,26,27]。1997年,卫生部发布了《60Co辐照中药杀菌剂量标准》(内部试行)的通知(卫药发[1997]第38号),允许辐照中药材品种共198种,葛根位列其中[15]。而采用电子束辐照灭菌葛根中药材饮片、提取物及其制剂尚鲜见报道。本研究结果表明,60Co-γ射线和电子束辐照均能有效降低葛根提取物中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数,随着吸收剂量增大,对微生物的抑制作用逐渐增强,且60Co-γ射线辐照对葛根提取物的灭菌能力优于电子束辐照。袁忠谊[19]利用电子束和60Co-γ射线辐照对左归丸粉进行杀菌处理,发现二者的杀菌效果无差异,与本研究结论不一致,究其原因,辐照灭菌效果主要取决于辐照装置加工能力(放射源源强、电子束束能与功率)、被辐照物品的属性、辐射剂量率、污染微生物种类等因素。60Co-γ射线辐照灭菌中药的工艺已成熟,基本实现了商业化应用。但电子束辐照中药灭菌技术起步较晚,基础较薄弱,仅有利用电子束辐照左归丸[19]、西洋参[20]、党参[28]、黄连[29]及山银花[30]等中药材料及中成药的报道。

3.260Co-γ射线与电子束辐照灭菌对葛根提取物抗氧化活性的影响

葛根中的主要活性成分是以葛根素为主的异黄酮类化合物,其在维持心血管系统稳定性、保护脑神经、防止肝肾损伤、改善代谢与免疫功能等方面具有一定的药理作用[4,31]。而上述疾病的发生均不同程度地与机体内自由基的参与有着密切的相关性,自由基是诱发相关疾病的分子基础之一。DPPH·是一种稳定的自由基,被广泛应用于评价样品的体外抗氧化能力。·OH是一种毒性较强的活性氧自由基,是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素之一。抗氧自由基作用是生物有机体中较为普遍的自我保护机制之一,中药中的相关生物活性成分为加强这种保护机制提供了重要的物质基础[32]。近年来,国内外学者对葛根活性成分的提取分离及抗氧化活性开展了大量研究,发现葛根中的活性成分表现出较强的还原作用,对体外DPPH·、O−⋅22-⋅、·OH、H2O2等自由基均具有明显的清除能力,且随着活性成分浓度的增加而升高[33,34,35]。本研究从DPPH·清除率、·OH清除率和总还原能力3个方面评价了不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照对葛根提取物的抗氧化活性的影响,结果表明,2种辐照方式均不会对葛根提取物抗氧化活性产生显著影响,2种辐照方式之间也无明显差异。葛根提取物抗氧化活性取决于主要活性物质葛根素的含量,王芳等[25]、阮健等[26]和张强等[27]研究表明,60Co-γ射线辐照对中药主要有效成分葛根素的含量无影响,因而,60Co-γ射线辐照对葛根提取物的抗氧化活性无显著影响。而电子束辐照对葛根素含量及抗氧化活性的影响研究鲜有报道。

3.360Co-γ射线与电子束辐照灭菌对葛根提取物指纹图谱的影响

中药质量控制一直是中药研究与生产中的难点和热点,也是实现中药现代化的重要基础和关键。中药指纹图谱技术是当今国际公认的中药质量控制模式,已用于中药的质量评价与控制和新药研究[36,37]。中药成分具有复杂性和多样性,辐照灭菌可能会引起中药化学成分的变化,对中药的质量产生不确定的影响。近年来,利用指纹图谱分析技术评价辐照灭菌对中药质量的影响研究已有报道[38,39,40],但采用指纹图谱技术研究辐照灭菌葛根中药材及饮片、提取物尚鲜见。本研究采用HPLC指纹图谱技术考察不同剂量60Co-γ射线和电子束辐照葛根提取物指纹图谱的差异,结果显示,2种辐照处理样品的指纹图谱均无显著差异,表明60Co-γ射线和电子束辐照均不会对葛根提取物中葛根素含量及整体化学成分一致性产生明显影响。王芳等[25]研究发现10kGy剂量60Co-γ射线辐照对保济丸主要成分葛根素质量分数无显著影响。阮健等[26]研究60Co-γ射线辐照对中成药通脉颗粒成分的影响,发现辐照剂量为10kGy时,其有效成分葛根素含量未发生显著变化。张强等[27]报道了3kGy剂量60Co-γ射线辐照不影响柴葛退热散中葛根素的含量。上述研究结果均显示,低于10kGy剂量60Co-γ射线辐照不会对中成药中主要有效成分葛根素的含量产生明显影响,与本研究结果一致。

4、结论

本研究采用不同剂量60Co-γ射线与电子束辐照葛根提取物,并以需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、DPPH·清除率、·OH清除率和总还原能力以及指纹图谱为评价指标,考察2种辐照方式对葛根提取物药材质量的影响及其差异性。结果显示,2种辐照方式对需氧菌、霉菌和酵母菌均有较强的抑制作用,二者效果一致,随着吸收剂量增大抑制作用增强。辐照吸收剂量低于10kGy时,2种辐照方式均不会对葛根提取物的抗氧化活性及指纹图谱产生显著影响,二者之间也无明显差异。由此可见,10kGy以内剂量的60Co-γ射线与电子束辐照能有效提高葛根提取物卫生指标,对其主要有效成分及功能活性未产生明显的破坏,不会影响葛根提取物的有效性及质量稳定性。本研究为葛根提取物及其中成药制剂的辐照灭菌,特别是电子束辐照灭菌的应用提供了理论依据。

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