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抑制酪氨酸酶及抗氧化活性应用三七叶提取物的作用分析

2020-06-20 1093 上传者：管理员

摘要：以三七叶乙醇提取物为原料，经HP-20大孔吸附树脂分离，采用DPPH自由基清除作用和酪氨酸酶抑制作用评价其抗氧化与美白作用。结果表明三七叶经大孔树脂富集后，50%乙醇洗脱段抑制酪氨酸酶活性是熊果苷的1.1倍，70%乙醇洗脱段抗氧化作用为Vc的1.4倍。结论是三七叶乙醇提取物用大孔吸附树脂富集，50%部位的美白作用较强，可以作为天然产物成分开发化妆品。

关键词：
三七叶
中药
抗氧化活性
酪氨酸酶
黄酮
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三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]为五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材，又名血参、金不换等。近五年来，三七种植面积发展迅速，2014年达到了79万亩，用药部位总产量4.5万公斤；2017年云南省种植面积45万亩左右[1]。中国药典规定用药部位为其干燥根和根茎，对三七茎叶资源综合利用很少，以茎叶为例，2017年产量2 500万kg，但仅有100万kg的茎叶被利用，其余均被深耕还土作为肥料处理。现代药理学研究表明，三七茎叶具有活血化瘀、镇静安神、镇痛消炎、促进消化等功效。云南当地人有采三七叶煮水洗脸的习俗，经常使用可有效去除面部的黄褐斑等。有文献报道三七叶乙醇提取物具有较好的抗氧化作用（清除ABTS和DPPH），其化学成分主要为糖类、黄酮、皂苷等。

因此，为了充分利用三七茎叶资源和发现三七茎叶中起美白作用的物质，本文采用HP-20大孔吸附树脂对三七茎叶提取物进行分离划段，通过酪氨酸酶和1,1-二苯基-2-苦阱基，对各部位的抑制酪氨酸酶活性和抗DPPH活性进行筛选，以发现其起美白作用的物质基础。

1、实验

1.1原料与试剂

三七茎叶11月份采于云南省文山市德厚镇，自然晒干，粉碎，过40目筛。

Folin-Ciocalteu试剂（中国食品药品鉴定研究所）；L-酪氨酸（美国Sigma公司）、熊果苷对照品（中国食品药品鉴定研究所，批号：B97Z-3NRQ，纯度99.7%）；没食子酸对照品（中国食品药品鉴定研究所，批号：MUST-15042910，纯度99.04%）；蘑菇酪氨酸酶（25KU）、芦丁（上海融禾医药科技有限公司）、1,1-二苯基-2-苦阱基（DPPH）（阿拉丁试剂有限公司）；甲醇、无水乙醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、钼酸钠、钨酸钠、硫酸锂、亚硝酸钠、硝酸铝、双氧水、氢氧化钠等试剂（分析纯，北京精求化工有限责任公司），超纯水（娃哈哈矿泉水）。

1.2仪器与设备

岛津2550型紫外分光光度计(日本岛津)；Spextra Max 190酶标仪（美国美谷分子仪器）；十万分之一电子天平（美国奥豪斯EX225ZH-AD);IKA RV10 Basic旋转蒸发仪（德国艾卡）；HP20大孔吸附树脂（三菱DIAION);PH计（成都世纪方舟）；VFD-1000冻干机（北京博医康）。

1.3实验方法

1.3.1供试品的制备

称取三七叶粉末2.35 kg,70%乙醇回流提取，料液比（1∶10），回流3次，每次1 h，合并3次提取液，旋转蒸发回收溶剂，得浸膏486 g。取50 g浸膏用70℃热水混悬（生药浓度约为0.6 g/mL),HP-20大孔吸附树脂（内径：9.5 cm，柱高：60 cm;BV=4.3L），树脂预处理（商品HP20大孔吸附树脂95%乙醇浸泡48 h，装柱，95%乙醇洗至无白色杂质，水洗至无醇味，5%盐酸洗脱2 BV，水洗至中性，2%氢氧化钠洗脱2 BV，水洗至中性）；湿法上柱，蒸馏水洗脱2 BV（流速BV/h，洗脱液弃去），30%乙醇洗脱4 BV（流速2 BV/h),50%乙醇洗脱4 BV（流速2 BV/h),70%乙醇洗脱4 BV（流速2BV/h),95%乙醇洗柱。各部位洗脱液减压回收，30%部位得2.3 g,50%部位得36.5 g,70%部位得4.8 g,95%部位得2 g。

1.3.2总黄酮含量测定

采用分光光度计法测定总黄酮含量，参照文献稍作调整[5]，以芦丁为对照品于500 nm处测定其吸收值。

1.3.2. 1标准溶液的配置

精密称取芦丁标准品10.24 mg于烧杯中，50%乙醇溶解后，转移至50 mL容量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，制成浓度为0.204 8 mg/mL的标准品储备液。

1.3.2. 2标准曲线的制作

将芦丁标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL移液到25 mL容量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠1.0 mL，摇匀，静置反应6 min,10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min,40%氢氧化钠1.0 mL，再加50%乙醇定容至刻度，放置反应15 min，上述溶剂是空白对照，在500 nm处测定其吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线，便求出回归方程：A=0.2085C-0.0148，相关系数R=0.999 1，线性范围0.08～0.5 mg。

1.3.2. 3各组分总黄酮含量的测定

在100 mL容量瓶中准确称取100 mg各组分样品，加50%乙醇溶解，超声处理10 min，定容，作为待测样品液。用上述方法处理样品作为测试溶液，在500 nm处用分光光度计测定其吸光度值，并且根据线性方程计算含量。

1.3.3抑制酪氨酸酶活性的测定

酪氨酸酶是黑色素生成过程中的主要限速酶，酪氨酸酶抑制模型是目前美白功效常用的评价方法和筛选模式[2]。本实验方法参照参考文献[3]，稍作调整。

称取各提取物10.00 mg，用PBS缓冲液为溶剂，分别配制成浓度为5、2、1、0.6、0.3、0.1 mg/mL的供试品溶液。将50μL不同浓度的各样品溶液、PBS溶液80μL、酪氨酸酶溶液50μL依次加入96孔板中，设3个复孔，在37℃下孵育10 min，再向每个孔中加入20μL底物触发反应，孵育30 min，用酶标仪测定475 nm处的吸光度值，重复测定3次。记录A、B、C、D的吸光度值。抑制率计算公式如下：抑制率=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100%，其中，A为空白对照组（PBS 130μL+酶50μL+底物20μL）在475 nm处测定的吸光度；B为空白背景组（PBS 180μL+底物20μL）在475 nm处测定的吸光度；C为实验组（PBS 80μL+酶50μL+供试品溶液50μL+底物20μL）在475 nm处测定的吸光度；D为实验背景组（PBS 130μL+供试品溶液50μL+底物20μL）在475 nm处测定的吸光度；本实验用熊果苷标准品做对照。

1.3.4抗氧化性测定

本实验方法参照参考文献[4]，稍作调整。

各称取不同提取段10.00 mg样品，用无水乙醇溶解，配制成0.10～1.00 mg/mL 10种不同浓度的供试液样品。设3个实验组：空白组（无色乙醇5 mL+DPPH溶液5 mL）、样品组（待测样品5 mL+DPPH溶液5 mL）、本底组（待测样品5 mL+无色乙醇5 mL）。各组进行DPPH自由基清除实验。吸取各组相关溶液混合，避光反应30 min,517 nm波长处测定吸光度值。DPPH自由基清除率=（A样品-A本底）/A空白×100%。本实验用VC做对照。

1.3.5半数清除率的计算

半数清除率指清除率为50%时所需的样品浓度，将待测抗氧化剂配制成系列溶液，测定各浓度抗氧化剂对DPPH自由基清除率，在清除率0～100%的范围内，绘制清除率对浓度曲线，根据线性方程计算出清除率为50%时的浓度值，即IC50值。IC50值越低，说明其抗氧化活性越高。如上计算抑制酪氨酸酶活性IC50值。

2、结果与分析

2.1总黄酮的提取与质量分数的测定

应用HP-20大孔吸附树脂对三七叶总提取物进行分离，30%乙醇洗脱4 BV（流速2 BV/h),50%乙醇洗脱4 BV（流速2 BV/h),70%乙醇洗脱4 BV（流速2 BV/h),95%乙醇洗柱。各部位洗脱液减压回收，30%部位得2.3 g,50%部位得4.8 g,70%部位得36.5 g,95%部位得3 g。

准确称取各组分样品100 mg，加50 mL50%乙醇在烧杯中超声处理10 min溶解后，转移至100 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，配制成1 mg/mL的待测样品液。上述样品溶液，在500 nm处用分光光度计测定其吸光度值，并且根据线性方程计算含量。由含量计算出各样品段总黄酮重量和质量分数。结果见表1。

表1三七叶粗提物及各提取段总黄酮含量

由表1可知，三七叶总黄酮在HP-20树脂中主要在50%乙醇部位会被洗脱，总黄酮的质量分数由粗提物总的6.54%提高至58.54%，达到有效分离的目的。

2.2三七叶各提取物对抑制酪氨酸酶活性的影响

称取各提取物10.00 mg，用PBS缓冲液为溶剂，分别配制成浓度为5、2、1、0.6、0.3、0.1 mg/mL的供试品溶液。按照1.3.3的方法处理样品，用酶标仪在475 nm处测定其吸光度值，再利用1.3.5的方法绘制提取物不同浓度对吸光度值的曲线，根据线性方程计算出抑制率为50%时的浓度值，即IC50值。IC50值越低，说明其抑制活性越高。结果见表2。

表2三七叶粗提物及各提取段抑制酪氨酸酶IC50值

结果显示，三七叶提取物均对酪氨酸酶有抑制活性，其IC50(mg/m L）值在0.482～2.586之间，与对照品熊果苷相比，50%乙醇洗脱段抑制酪氨酸酶活性是熊果苷的1.1倍，为0.482 mg/mL。显示其确实有美白效果，可以作为美白类物质进行深度开发。

2.3三七叶粗提物及各提取段抗氧化影响

称取各提取物样品10.00 mg，用无水乙醇溶解，配制成0.10～1.00 mg/mL 10种不同浓度的供试液样品。按照1.3.4的方法处理样品，在517 nm波长处测定吸光度值。DPPH自由基清除率=（A样品-A本底）/A空白×100%。本实验用VC做对照。各浓度抗氧化剂对DPPH自由基清除率，在清除率0～100%的范围内，绘制清除率对浓度曲线，根据线性方程计算出清除率为50%时的浓度值，即IC50值。IC50值越低，说明其抗氧化活性越高，结果见表3。

表3三七叶粗提物及各提取段抗氧化IC50值

结果显示，三七叶提取物均表现出一定的清除DPPH自由基的能力，与对照品VC相比，70%乙醇洗脱段抗氧化作用为Vc的1.4倍。对照文献[6]，三七叶70%乙醇洗脱段主要是皂苷类物质，其抗氧化能力可能与皂苷的含量密切相关。

3、结论

三七与人参是同科同属植物，现代药学研究表明两者的化学物质也极其相似。人参应用于化妆品有上千年的历史，最早记录于神农本草，现代化妆品工业中主要应用人参提取物作为天然产物成分添加于化妆品中[7]。研究表明人参美容的物质基础主要为皂苷类成分，三七的总皂苷含量比人参高30%左右，因此三七作为化妆品天然产物添加成分具有很大的潜力。

本实验采用HP-20大孔吸附树脂对三七叶乙醇提取物进行分离，HP-20树脂相较于D101、AB-8等常用树枝，具有机械强度高、吸附和解析效能好等优点；结果表明50%乙醇洗脱段抑制酪氨酸酶的活性是熊果苷的1.1倍，70%乙醇洗脱段抗氧化作用为Vc的1.4倍。

因此，可以利用三七叶乙醇提取物经HP-20大孔吸附树脂富集，50%的洗脱物作为美白成分开发，即符合当前以天然产物成分为化妆品发展的趋势，也为三七茎叶的综合利用提供科学依据，提高了农产品的经济价值。而抗氧化能力与抑制酪氨酸酶活性之间没有正相关性，这表明三七叶的抗氧化作用是否与其美白功效有关，还需进一步的研究。

参考文献：

[1]崔秀明,黄璐琦.依靠科技进步促进三七产业创新发展[J].中国现代中药,2018(3):247-252.

[4]程启斌,李石飞,张立伟.连翘不同部位总酚含量测定及抗氧化活性比较研究[J].化学研究与应用,2016(5):610-616.

[5]张志信,张仕秀,胡彦.三七茎叶中叶苷及黄酮的同步分离工艺研究[J].时珍国医国药,2010(5):1139-1141.

[6]赵保,徐暾海,郭德海.人参皂苷Rg1对人黑素细胞株MV3黑素合成的影响[J].人参研究,2011(2):9-11.

[7]姜锐,孙立伟,赵大庆.人参美容护肤作用机制及应用研究进展[J].世界科学技术—中医药现代化,2016(11):1988-1992.

宋建平,张志信,娄洁.三七叶提取物抑制酪氨酸酶及抗氧化活性研究[J].文山学院学报,2020,33(03):1-4.