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滇重楼内生真菌米曲霉中2个新的α-吡喃酮类化合物

2020-10-12 187 上传者：管理员

摘要：目的研究滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillusoryzae次生代谢产物的化学成分及结构。方法将米曲霉采用液体发酵方式发酵，萃取后运用多种色谱方法进行分离纯化，并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从滇重楼内生真菌米曲霉发酵产物中分离鉴定了4个化合物，分别鉴定为4-羟基-6-[(2S,3S)-3-羟基丁烷-2-基]-3-甲基-2H-吡喃-2-酮(1)、(R)-4-羟基-6-(1-羟基-2-甲基丙基)-3-甲基-2H-吡喃-2-酮(2)、flufuran(3)、flufuranmethylester(4)。结论化合物1、2为新的α-吡喃酮类化合物，命名为米曲霉α-吡喃酮A和米曲霉α-吡喃酮B。

关键词：
α-吡喃酮
中药学
内生真菌
化合物
次生代谢产物
滇重楼
米曲霉
米曲霉α-吡喃酮B
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植物内生真菌是指一定周期或部分周期生活于各个器官或组织中的真菌，是植物体内重要的生物类群，被认为与其寄主互利共生，寄主植物提供养分给内生真菌，而内生真菌又能产生生物活性物质，从而决定了其次生代谢产物具有化学结构和生物活性的多样性，成为近年来发现新天然产物的重要来源[1,2,3,4]。

滇重楼为百合科重楼属植物，具有消炎抑菌、抗肿瘤、止血等作用，其活性物质主要为薯蓣皂苷和偏诺皂苷等甾体皂苷类成分，是云南白药、季德胜蛇药、热毒清、宫血宁等多种中成药的主要原料，用途非常广泛[5,6]。当前，重楼的发展面临野生资源消耗过快、人工种植种苗繁育技术难度大、生长周期长等难题。这些特性使得重楼成为当前药用植物内生菌的研究热点植物之一，重楼内生菌的研究对于其资源保护和开发利用具有非常重要的意义[7]。

米曲霉Aspergillusoryzae(Ahlb.)Cohn属半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科，是曲霉属真菌中的一个常见种。其在我国以及整个亚洲地区的发酵食品中都有着非常广泛的应用，从其发酵产物中分离得到的化合物有百余种，有真菌毒素，也有生物碱类等化学成分[8,9,10,11,12]。本研究对来自云南大理的滇重楼进行内生真菌培养，分离培养得到的米曲霉次生代谢产物，前期得到1个新的聚酮类化合物米曲霉聚酮A[13]。此次培养得到的米曲霉次生代谢产物中分离得到4个化合物，分别鉴定为4-羟基-6-[(2S,3S)-3-羟基丁烷-2-基]-3-甲基-2H-吡喃-2-酮（4-hydroxy-6-[(2S,3S)-3-hydroxybutan-2-yl]-3-methyl-2H-pyran-2-one,1）、(R)-4-羟基-6-(1-羟基-2-甲基丙基)-3-甲基-2H-吡喃-2-酮[(R)-4-hydroxy-6-(1-hydroxy-2-methylpropyl)-3-methyl-2H-pyran-2-one,2]、flufuran(3）、flufuranmethylester(4），其中化合物1、2为新化合物，命名为米曲霉α-吡喃酮A和米曲霉α-吡喃酮B。

1、材料

1.1仪器与试剂

Agilent-1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；UtimateXB-phenyl半制备色谱柱（250mm×10mm,5μm；天津博纳艾杰尔科技有限公司）；BrukerAVШ-400型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Autospec-3000型质谱仪（英国VG公司）；AutopolV型旋光测定仪（美国鲁道夫公司）；UV-2401A型紫外分光光度计（日本岛津股份有限公司）；DLSB-5L/25型低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；Hei-VAPValueDigital型旋转蒸发仪、RotavacValueControl型循环水式真空泵（德国Heidolph公司）；柱色谱硅胶（100～200、200～300目）和GF254(100mm×100mm）硅胶板均为青岛海洋化工厂生产；D101型大孔树脂（天津普拉德生物科技有限公司）；工业用乙醇、醋酸乙酯、甲醇、二氯甲烷（呈贡祥化玻璃仪器厂）；AR级甲醇（天津天泰精细化学品有限公司）；薄层色谱显色剂为10%H2SO4乙醇溶液；BR级D-色氨酸（上海圻明生物科技有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；发酵所用水为灭菌后的自来水。

1.2药材

本实验所用菌株是于2012年从产自云南大理的滇重楼的根茎中分离所得，由云南民族大学陈毅坚教授鉴定为滇重楼内生真菌米曲霉Aspergillusoryzae(Ahlb.)Cohn，现保存于云南民族大学民族药资源化学重点实验室。

2、发酵、提取和分离

2.1菌株的发酵

通过前期多种发酵的结果对比分析，选择采用液体发酵（察式培养基+D-色氨酸，D-色氨酸含量为0.2g/L）方式进行米曲霉菌株的扩大发酵。发酵前，在250mL锥形瓶中配制察氏液体培养基来做母瓶发酵，每瓶100mL。液体扩大发酵时将发酵所需的液体培养基扩大比例倒入发酵罐中，1次发酵30L，然后将发酵罐高温灭菌，冷却到室温后，将母瓶倒入发酵罐中，在28℃、121r/min下有氧发酵5～7d，照此方法发酵4罐。

每罐发酵完成后，发酵液装入50L的塑料桶中，滤过使菌液和菌丝体分开。菌液用D101型大孔树脂吸附，再用95%工业乙醇洗脱，浓缩得到菌液浸膏；菌丝体用95%工业乙醇提取，再用醋酸乙酯溶液萃取，浓缩后得到菌丝体浸膏。4罐菌液和菌丝体都用此方法，最后将菌液浸膏和菌丝体浸膏合并，得到总浸膏145g。

2.2提取与分离

对液体发酵总浸膏145g进行化学成分分离。首先用甲醇溶解，用100～200目的硅胶进行硅胶柱色谱粗分，以二氯甲烷-甲醇（30∶1、20∶1、10∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0∶1）梯度洗脱，根据薄层色谱检识结果，合并相同组分，得到9个流分（Fr.A～I）。Fr.C(20∶1部分，13g）用二氯甲烷-甲醇（35∶1、25∶1、15∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脱，得到5个组分Fr.C1～C5。Fr.C2(25∶1部分）进行HPLC分离，样品用甲醇溶解，以75%甲醇水作为流动相，用UtimateXB-phenyl半制备色谱柱（250mm×10mm,5μm）分离，体积流量3mL/min，收集3.2min的色谱峰得到化合物1(12.3mg），收集4.8min的色谱峰得到化合物2(10.6mg），收集8.6min的色谱峰得到化合物3(20.2mg），收集9.0min的色谱峰得到化合物4(32.7mg）。

3、结构鉴定

化合物1：浅黄色油状物，[α]D2516.7(c0.001,MeOH);UVλmaxMeOH(nm):283(2.99),204(2.66);ESI-MSm/z:197[M-H]-，以及高分辨质谱HR-ESI-MSm/z:197.0824[M-H]-，结合1H-和13C-NMR谱确定分子式为C10H14O4，不饱和度为4。观察化合物的1H-NMR，有1个双键质子信号（δH6.00,s),2个次甲基信号（包括1个连氧次甲基δH3.91,m）以及3个甲基信号（包括1个单峰甲基信号δH1.84,s）。13C-NMR和DEPT数据（表1）显示了10个碳信号，包括4个季碳信号（1个羰基信号和3个sp2杂化的季碳）、3个次甲基信号（1个sp2杂化、1个连氧的和1个sp3杂化的次甲基）以及3个甲基信号。根据以上信号及分子式判断化合物有2个双键和1个酯羰基，再结合不饱和度，化合物应该具有1个环，是1个吡喃酮类化合物，与已知化合物3,4-dimethyl-2-pyrone[14]相似。不同之处在于化合物1的C-4位取代基变为羟基，且C-6位多了1个3-羟基丁烷基取代。此变化可通过HMBC谱中观察到的H-11与C-3、C-4、C-2的相关，H-7与C-6、C-10、C-8的相关以及H-9与C-8、C-7的相关得到证实。此支链还通过H-9/H-8/H-7/H-10的1H-1HCOSY相关得到确认（图1）。至此，化合物1的平面结构得以确定。关于C-7和C-8的绝对构型的确定是通过与已知化合物(-)-pyrenocineE[15]对比，两者H-8的化学位移值均为(δH3.75～3.92,m)，因此C-8为S构型。最终鉴定化合物1为4-羟基-6-[(2S,3S)-3-羟基丁烷-2-基]-3-甲基-2H-吡喃-2-酮，结构见图2，命名为米曲霉α-吡喃酮A。

化合物2：浅黄色油状物，[α]D258.3(c0.001,MeOH);UVλmaxMeOH(nm):286(2.91),205(2.51)nm;ESI-MSm/z:197[M-H]-，以及高分辨质谱HR-ESI-MSm/z:197.0824[M-H]-，结合1H-和13C-NMR谱确定分子式为C10H14O4，不饱和度为4。观察化合物的1H-NMR，有1个双键质子信号(δH5.99,s),2个次甲基信号（包括1个连氧次甲基δH3.92,m）以及1对双峰甲基信号[δH(1.18,d,J=6.7Hz),(1.18,d,J=6.7Hz)]和1个单峰甲基信号δH(1.84,s)。13C-NMR和DEPT数据（表1）显示了10个碳信号，包括4个季碳信号（1个羰基信号和3个sp2杂化的季碳），3个次甲基信号（1个sp2杂化，1个连氧的和1个sp3杂化的次甲基）以及3个甲基信号。根据以上信号及分子式判断化合物有2个双键和1个酯羰基，再结合不饱和度，化合物应该具有1个环，是1个吡喃酮类化合物，与已知化合物3,4-dimethyl-2-pyrone[14]相似。不同之处在于化合物2的C-4位取代基变为羟基，且C-6位多了1个2-羟基丁烷基取代。此变化可通过HMBC谱中观察到的H-11与C-3、C-4、C-2的相关，H-7与C-6、C-10和C-8的相关以及H-9与C-8、C-7的相关得到证实。此支链还通过H-7/H-8、H-8/H-9、H-8/H-10的1H-1HCOSY相关得到确认（图1）。化合物2中H-7绝对构型的确立是通过与化合物1的H-8的化学位移值对比均为(δH3.90,m)左右，因此C-7为S构型，C-8为R构型。最终鉴定化合物2为(R)-4-羟基-6-(1-羟基-2-甲基丙基)-3-甲基-2H-吡喃-2-酮，结构见图2，命名为米曲霉α-吡喃酮B。

表1化合物1、2的核磁共振数据(500/125MHz,CD3OD)

图1化合物1和2的主要HMBC(箭头)和1H-1HCOSY（实线）相关

图2化合物1和2的结构

化合物3：橙色晶体（甲醇），分子式为C6H6O4,ESI-MSm/z:143[M+H]+。1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:7.98(1H,s,H-2),6.53(1H,s,H-4),4.43(2H,s,H-7);13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:175.7(C-6),169.4(C-5),148.1(C-3),139.7(C-2),110.8(C-4),60.9(C-7)。波谱数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物为flufuran。

化合物4：橙色晶体化合物（甲醇），分子式为C7H8O4,ESI-MSm/z:157[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.03(1H,s,H-2),6.53(1H,s,H-4),4.46(2H,s,H-7),3.81(3H,s,H-8);13C-NMR(100MHz,CD3OD)δ:176.7(C-6),170.9(C-5),149.7(C-3),140.5(C-2),111.5(C-4),61.1(C-7),57.0(C-8)。波谱数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物为flufuranmethylester。

4、讨论

本实验对滇重楼内生真菌米曲霉次生代谢产物的化学成分进行研究，运用多种分离纯化和鉴定技术，从米曲霉发酵液的提取物中分离得到4个化合物，其中2个是新的α-吡喃酮类化合物，此类化合物多为真菌的次级代谢产物，具有杀虫抗菌等活性[17]。由此可推测此类化合物可能为滇重楼中内生真菌米曲霉分泌的保护植物的成分，为重楼属植物内生真菌次生代谢产物与宿主植物的关系提供了一定的科学依据。

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