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HPLC法同时测定芩黄喉症胶囊中10种成分

2023-08-19 73 上传者：管理员

摘要：建立HPLC法同时测定芩黄喉症胶囊中栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。方法该药物甲醇提取液的分析采用Thermo ODS Hypersil C18色谱柱(5μm, 4.6 mm×250 mm);流动相乙腈-甲醇-0.2%磷酸，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长254 nm。结果 10种成分在各自范围内线性关系良好(r>0.999 0),平均加样回收率95.24%～103.10%,RSD 0.57%～1.44%。结论该方法简便灵敏，重复性好，可用于芩黄喉症胶囊的质量控制。

关键词：
HPLC
化学成分
咽喉肿痛
芩黄喉症胶囊
非处方药
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芩黄喉症胶囊由黄连、人工牛黄、冰片、黄芩浸膏、栀子、郁金、大黄浸膏组成，具有清热解毒、消肿止痛功效，是鼻喉科喉痹类非处方药，常用于治疗热毒内盛引起的咽喉肿痛，但其现行质量标准[1]仅以黄芩、冰片为含量测定指标，处方用量较大的黄连也仅是TLC定性鉴别，导致药味质量难以保证，并且文献[2,3,4,5,6]也仅对1～2味药进行含量测定。因此，本实验建立HPLC法同时测定芩黄喉症胶囊中栀子所含栀子苷，黄连所含盐酸小檗碱，黄芩所含黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，大黄所含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，以期为该制剂质量标准完善提供参考。

1、材料

1.1仪器

LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司);XS205DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-700DV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);0.45μm微孔滤膜(天津市色谱科学技术公司)。

1.2试剂与药物

栀子苷(批号110749-201919,纯度97.1%)、盐酸小檗碱(批号110713-202015,纯度85.9%)、黄芩苷(批号110715-201821,纯度95.4%)、汉黄芩苷(批号112002-201702,纯度98.5%)、黄芩素(批号111595-201808,纯度97.9%)、芦荟大黄素(批号110795-202011,纯度97.5%)、汉黄芩素(批号111514-201706,纯度100%)、大黄酸(批号110757-201607,纯度99.3%)、大黄素(批号110756-201913,纯度96.0%)、大黄酚(批号110796-201922,纯度99.4%)、大黄素甲醚(批号110758-201817,纯度99.2%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。芩黄喉症胶囊共3批，分别编号001(辽宁美大康华邦药业有限公司，每粒装0.4 g,批号210401)、002[葵花药业集团(吉林)临江有限公司，每粒装0.4 g,批号20211002]、003(辽宁美大康华邦药业有限公司，每粒装0.4 g,批号200601),均购自市场。磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

2、方法与结果

2.1色谱条件

Thermo ODS Hypersil C18色谱柱(5μm, 4.6 mm×250 mm);流动相甲醇(A)-乙腈(B)-0.2%磷酸(C),梯度洗脱，程序见表1;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长254 nm。

表1梯度洗脱程序

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液

精密称取栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，置于量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(各成分质量浓度分别为260.69、538.33、576.08、45.200、28.600、2.208 2、20.900、0.878 50、6.514 8、1.852 5μg/mL)。

2.2.2供试品溶液

取本品10粒，倾出内容物，混匀研细，精密称取0.4 g,置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，称定质量，超声处理30 min,取出，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性样品溶液

按照处方工艺，分别制备缺栀子、缺黄芩浸膏、缺黄连、缺大黄浸膏的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3专属性试验

取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下各进样20μL测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分色谱峰保留时间与相应对照品一致，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1各成分HPLC色谱图

2.4线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.25、5、7.5、10、25 mL,置于25 mL量瓶中，甲醇稀释定容，在“2.1”项色谱条件下各进样20μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2各成分线性关系

2.5稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液(编号001)适量，于0、2、8、10、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为1.85%、1.74%、0.96%、1.12%、1.54%、0.95%、1.22%、1.75%、0.68%、0.74%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为1.01%、0.85%、0.94%、0.52%、0.88%、1.34%、0.72%、1.77%、0.55%、0.67%,表明仪器精密度良好。

2.7重复性试验

取本品(编号002)适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为0.98%、1.24%、1.09%、0.95%、1.03%、1.74%、0.99%、0.85%、0.57%、0.62%,表明该方法重复性良好。

2.8加样回收率试验

取各成分含量已知的本品(编号002)6份，每份约0.2 g,精密称定，精密加入“2.2.1”项下对照品溶液10 mL,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均加样回收率分别为98.52%、96.80%、101.25%、95.24%、98.07%、99.88%、103.10%、97.88%、96.40%、99.29%,RSD分别为1.36%、1.01%、1.24%、0.94%、1.05%、1.44%、0.92%、0.90%、0.82%、0.57%。

2.9样品含量测定

取本品3批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取它和对照品溶液各20μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见表3。

表3各成分含量测定结果(mg/g, n=3)

3、讨论

3.1检测成分选择

前期报道，盐酸小檗碱为黄连指标成分，栀子苷为栀子指标成分，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素为黄芩指标成分，芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为大黄指标成分。因此，本实验选择上述成分进行含量测定。

3.2检测波长选择

本实验采用DAD检测器进行扫描，发现在254 nm波长处可兼顾各成分吸收，与其他色谱峰分离度较高，峰纯度符合含量测定要求，阴性无干扰，故选择其作为检测波长。

3.3流动相选择

本实验考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、甲醇-乙腈-磷酸[7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18],发现以乙腈-甲醇-0.2%磷酸梯度洗脱时基线平稳，各成分色谱峰峰形、分离度、理论塔板数良好，阴性无干扰，故选择其作为流动相。

3.4提取方式选择

本实验根据各成分化学性质及处方工艺，分别考察了超声、加热回流、水浴提取及提取溶剂70%甲醇、甲醇、盐酸-甲醇(1∶100)、二氯甲烷-甲醇-1%冰醋酸(25∶25∶4)[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18],发现甲醇超声提取时操作便捷，各成分能被同时提取，故选择其作为提取方式。

3.5色谱柱选择

本实验分别考察了依利特Supersil ODS、Thermo ODS Hypersil C18、Zafex Supfex RP-C18、岛津Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5μm),发现分离效果均良好，表明该方法稳定耐用。

4、结论

本实验建立HPLC法同时测定芩黄喉症胶囊中栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，该方法分离度、精密度、重复性均能达到药物含量测定要求，可为该制剂质量标准完善提供参考，同时也能为相似制剂质量研究提供思路。另外，不同厂家生产的芩黄喉症胶囊中上述成分含量存在一定差异，是否存在以劣充好的情况还有待收集更多样品作进一步研究。

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