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UPLC-MS/MS法定性与定量检测川楝子中的川楝素

2023-10-25 272 上传者：管理员

摘要：目的：建立通过超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，对川楝子药材中的川楝素进行定性鉴别及含量测定的方法。方法：样品经过甲醇加热回流提取后，采用UPLC-MS/MS，以乙腈-0.01%甲酸(31∶69)为流动相，以SB-C18色谱柱为分析柱，离子源为电喷雾电离负离子模式，分别采用Q3及Q1扫描模式，对川楝子中的川楝素进行快速定性定量检测。结果：所建立的方法能快速定性、定量检测川楝素，定性检测的离子对为m/z 573.0→457.2，川楝素浓度在0.522～26.100μg/mL范围内线性良好，平均加样回收率为97.5%，检出限为6μg/g，定量限为20μg/g。结论：所建方法快速、准确、灵敏，适用于川楝子中川楝素的定性鉴别及含量测定。

关键词：
定性定量检测
川楝子
川楝素
疏肝泄热
超高效液相色谱-串联质谱法
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川楝子为楝科植物川楝(Melia toosendan Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果实，味苦，性寒，有小毒，具有疏肝泄热，行气止痛，杀虫等作用[1]。川楝子的其中一个主要有效成分是川楝素，属于四环三萜类化合物[2]。川楝子长期以来用于杀虫或驱虫[3,4]，现代研究发现，川楝子和川楝素具有多种药理作用，例如抗肿瘤[5,6]、抗炎镇痛[7]、抗肉毒杆菌毒素[8]等。然而，川楝素同时具有一定的毒性作用，动物实验发现，过量服用川楝子可导致急性中毒[9]。另外，川楝子也具有一定的肝毒性、肾毒性、消化系统毒性和生殖毒性，川楝素是引起这些毒性的物质基础[10]。因此，在评价川楝子药材的质量时，必须重点关注川楝子中川楝素的含量，保证药材有效性的同时，避免引起药物的不良反应。

目前，川楝素的常见检测方法有HPLC-UV法、HPLC-ELSD法等[11,12]，但这些方法存在灵敏度低、前处理时间长、分析时间长等缺点。超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)法是近年发展较快的分析方法，该方法结合了超高效液相色谱与质谱两种方法，兼具两者优点，具有灵敏度高、选择性高、分析速度快等特点。本研究采用UPLC-MS/MS法，对川楝子中的川楝素进行定性鉴别和定量检测，提高了检验效率，有利于控制川楝子药材的质量，为药品检验和药品监管提供新的手段。

1、材料和仪器

1.1 药品与试剂

川楝素对照品(批号：111842-202105；纯度：93.9%)，购于中国食品药品检定研究院；乙腈(LC/MS级别，Fisher Scientific)；甲酸(LC/MS级别，Fluka)；实验用水为屈臣氏蒸馏水。川楝子样品分别来自樟树市庆仁中药饮片有限公司(批号：202107062)，江西樟树天齐堂中药饮片有限公司(批号：2106003)，天津达仁堂(亳州)中药饮片有限公司(批号：2004001)。

1.2 仪器

液相质谱联用仪为AB SCIEX 4500Qtrap，色谱柱为安捷伦InfinityLab Poroshell 120 SB-C18(2.1×100 mm,2.7μm)，电子分析天平为METTLER TOLEDO XPE206DR。

2、方法和结果

2.1 液相色谱-质谱条件

流动相为乙腈-0.01%甲酸(31∶69)，柱温为室温，流速设置为0.3 m L/min；进样量为2µL。离子源为电喷雾(ESI)离子源负离子模式。含量测定使用Q1检测模式，质荷比为573.0。定性鉴别以质荷比573.0作为母离子，使用Q3检测模式扫描子离子，DP设置为-40 V。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取川楝素对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.1044 mg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取川楝子中粉约0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

取上述对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下试验条件测定。对照品溶液和供试品溶液的总离子流图分别见图1和图2。川楝素的2个峰能够完全分离，对照品和供试品的保留时间一致，整个分析过程可以在10 min内完成。在Q3检测模式中，川楝素两个峰均能得到质荷比为457.2的子离子。

图1 对照品溶液总离子流图

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下的对照品溶液，使用甲醇稀释，得到浓度分别为0.522、2.088、5.220、10.440、26.100μg/mL的系列标准工作溶液。按“2.1”项下的试验条件测定，以川楝素两个峰面积之和为纵坐标(Y)，以对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=1020582.0903X+636613.5305，相关系数r=0.9987。川楝素在0.522～26.100μg/mL浓度范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下的对照品溶液，按照“2.1”项下的试验条件测定，重复进样6次，计算川楝素2个峰面积之和。结果得到川楝素2个峰面积之和的RSD为0.7%(n=6)，表明仪器精密度良好。

图2 供试品溶液总离子流图

2.6 定量限和检测限测定

将川楝素对照品溶液分别用甲醇稀释成100 ng/mL及30 ng/mL的溶液，按照“2.1”项下试验条件测定，计算川楝素面积较小峰的信噪比(s/n)。其中30 ng/ml作为仪器的检出限(s/n=3),100 ng/mL作为仪器定量限(s/n=10)。根据样品溶液制备方法，实际稀释倍数为50，因此该方法川楝素的检出限为6μg/g，定量限为20μg/g。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的川楝子中粉共9份，每份约0.25 g，分别精密加入三个质量水平的川楝素对照品，每个质量水平3份。按照“2.2.2”项下的试验方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件测定，计算川楝素2个峰面积之和，进一步计算回收率。计算后的平均回收率为97.5%,RSD为1.9%，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.8 样品含量检测

取3批川楝子样品，按“2.2.2”项下试验方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件测定，计算川楝素2个峰面积之和，得到样品中川楝素的含量，并检测川楝素2个峰的子离子。结果上述3批样品均检测到川楝素的两个峰，并检测到质荷比为457.2的子离子。含量测定结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3、讨论

目前，《中华人民共和国药典》(2020年版)采用液相色谱-质谱法对川楝子药材中的川楝素进行含量测定。由于川楝素具有一定毒性，药典对川楝子药材的川楝素含量上下限都作出规定。对于川楝素的定性鉴别，药典目前采用了薄层色谱的方法。该方法前处理过程繁琐，耗时较长，需经过超声提取1小时、离心、二氯甲烷多次提取等步骤，影响了检验工作的效率。本研究采用UPLC-MS/MS法，通过一级、二级质谱扫描，确立了川楝素的一个特征离子对m/z 573.0→457.2。对于其中m/z 457.2的信号，推测可能是川楝素丢失了CH3CO、CH2OH等多个基团后，所形成的碎片离子[M-2CH3CO-CH2OH]-，将在后续的研究中进一步验证。本研究将该离子对用于川楝素的定性鉴别，将一级质谱用于含量测定，建立了定量检测方法，实现了样品的一次前处理，即可进行鉴别和含量测定两个项目。虽然鉴别和含量测定需分别进样，采用不同模式进行检测，但一次进样仅需10分钟，对比薄层色谱鉴别法，仍然节省了大量时间，而且省去了薄层色谱样品制备中有机试剂的使用，符合现代实验学中环境保护方面的要求，也有利于实验人员的健康。方法学验证表明，本方法专属性强、稳定性好、灵敏度高、分析时间短，可快速、准确地用于川楝子中川楝素的检测，为川楝子的质量控制提供了新的思路和方法。

参考文献:

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