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大黄素调控P53/P21通路对H2O2诱导损伤HUVEC的保护

2023-10-25 111 上传者：管理员

摘要：目的研究大黄素对过氧化氢(H2O2)诱导损伤的血管内皮细胞(HUVEC)保护作用及作用机制。方法MTT法筛选H2O2造模浓度及大黄素给药浓度。取HUVEC细胞，分为正常对照组、H2O2模型组(终浓度100μmol/L H2O2)和大黄素4个不同剂量(终浓度15.0、7.5、5.0、2.5μmol/L)组，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。电镜和荧光显微镜观察细胞形态和结构，Hoechst法观察细胞凋亡，化学法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量；Western印迹检测各组细胞中P53、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3和P21蛋白的表达。结果与正常对照组比较，模型组HUVEC细胞增殖活力显著下降；细胞形态与结构改变；SOD、NO、NOS含量显著降低；P53、caspase-3和P21蛋白表达显著提高；经不同剂量大黄素干预后，能明显改善和拮抗H2O2对HUVEC的氧化损伤。结论大黄素对H2O2诱导的HUVEC氧化损伤具有显著保护作用，其作用机制可能是调控P53/P21/caspase-3通路、抑制HUVEC氧化损伤和细胞凋亡。

关键词：
P53/P21通路
保护作用
大黄素
血管内皮细胞(HUVEC)
过氧化氢(H2O2)
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全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1 500万人[1]。目前对心脑血管疾病的治疗，包括药物治疗、介入治疗、外科治疗等，其中药物治疗是基础，是最为重要和首选的方法，而中医药防治心脑血管疾病具有显著的特色和优势。大黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤[2,3,4]等多种药理作用。刘广等[5]发现大黄素可能通过抗氧化应激及抑制凋亡等途径对硫酸吲哚酚诱导的心肌损伤有一定的保护作用；孙攀兴等[6]发现大黄素通过调控Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB通路、抑制炎症对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞(HUVEC)细胞氧化损伤具有显著保护作用；刘鸣昊等[7]发现大黄素能通过调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/NF-κB信号传导通路，减轻肝脏炎症，治疗非酒精性脂肪性肝炎。凉血通瘀方为国医大师周仲瑛教授临床治疗出血性脑卒中(脑出血)的经验方，课题组前期研究发现，该方对患者脑内血肿和脑水肿治疗效果显著、并保护HUVEC[8]、改善凝血和炎症相关因子[9]及抑制脑组织NF-κB p65蛋白的表达[10]等作用。该方以大黄为君药，而大黄素是大黄的主要活性成分。本研究探讨大黄素对过氧化氢(H2O2)诱导损伤的HUAEC的保护作用及机制。

1、材料与方法

1.1 材料

大黄素标准品购自中国药品生物制品检定所；人脐静脉HUVEC株(上海细胞所);胰蛋白酶、DMEM高糖培养基(Gibco公司);胎牛血清(四季青);苯甲基磺酰氟(PMSF)、十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶试剂盒、RIPA蛋白裂解液(碧云天);二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、二抗(上海生工);一抗(Santa cruz);电化学发光(ECL)液(Bio-Rad);超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(建成生物)等。

1.2 药物制备

大黄素配制：二甲亚砜(DMSO,≤1 ml)溶解大黄素，单培定容至10 ml, 配成800 μmol/L的母液，置于-20 ℃冰箱保存备用。细胞培养：将DMEM培养液(含10%胎牛血清)加入HUVEC中，置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养1～2 d; 取出，胰蛋白酶(0.25%)消化2～3 min, 每周传代培养2～3次。

1.3 细胞增殖(MTT)实验

取处于指数生长期的细胞，胰蛋白酶消化2 min左右，用DMEM培养液配成1×105/ml细胞悬液，加入96孔板；实验分成正常组、模型组、DMSO对照组、2.5、5.0、7.5、15.0 μmol/L大黄素组；其中正常组加细胞悬液160 μl+生理盐水40 μl, 模型组加细胞悬液160 μl+生理盐水20 μl+H2O2 20 μl, DMSO对照组加细胞悬液160 μl+生理盐水20 μl+0.5%DMSO 20 μl, 2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L和15 μmol/L大黄素组加细胞悬液160 μl+大黄素药液20 μl+H2O2 20 μl; 37 ℃二氧化碳培养箱孵育24 h, 每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl, 置于37 ℃培养箱继续温育4 h, 吸弃上清液，加入150 μl DMSO,酶标仪490 nm波长测定OD值，计算细胞增殖率。

1.4 倒置显微镜观察细胞形态

倒置相差显微镜观察HUVEC传代贴壁后细胞的形态及生长状况。

1.5 Hoechst染色观察细胞凋亡

预先放置有盖玻片的6孔板中加入处于对数生长期的细胞悬液，细胞爬片后加入大黄素药液，荧光显微镜观察细胞结构变化。

1.6 透射电镜观察细胞形态

胰蛋白酶消化细胞，DMEM培养液配成细胞悬液移入小细胞瓶培养24 h, 加药后于37 ℃培养箱继续培养24 h, 胰酶消化、离心后弃上清收集细胞，戊二醛、四氧化锇前、后固定，经脱水、包埋、切片、乙酸双氧铀和枸橼酸铅染后，透射电镜观察细胞形态。

1.7 SOD、MDA、NO和NOS的测定

具体操作参照试剂盒说明书。

1.8 Western印迹检测蛋白表达

将HUVEC接种至6孔培养板中(每孔细胞数为4×104个),待80%长满后，吸弃原培养液，模型组和药物组分别加入含H2O2和大黄素的培养液，37 ℃培养箱24 h后磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，加入裂解液4 ℃裂解2 h; 12 000 r/min离心收集上清后BCA法蛋白定量调整蛋白浓度；适量蛋白样品变性处理；10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE,浓缩胶40 V,分离胶80 V),后电转移(120 mA,1 h)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；5%的脱脂奶粉封闭 1 h, PBST洗3次，加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜；PBST洗3次，加入二抗(1∶1 000),室温下摇荡孵育1 h, PBST 洗3次；电化学发光(ECL)法检测蛋白。

1.9 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行t检验，蛋白表达采用Image Lab5.2.1软件分析。

2、结果

2.1 H2O2浓度筛选

H2O2浓度越大，对细胞增殖的抑制作用越明显；两者呈现明显的量效关系，其中终浓度为100 μmol/L的H2O2能显著抑制HUVEC细胞增殖，鉴于此本实验以100 μmol/L的H2O2作为模型组剂量。

2.2 大黄素有效作用剂量筛选

随着大黄素剂量的增加，其促进细胞增殖的作用不断减弱，当大黄素剂量>20 μmol/L时，对HUVEC细胞增殖显示有抑制作用，因此本实验选择大黄素15.0、7.5、5.0、2.5 μmol/L 4个剂量(终浓度)进行后续实验。

2.3 大黄素对HUVEC细胞增殖的影响

与模型组相比，不同剂量大黄素组均能提高HUVEC细胞增殖，其中5.0 μmol/L大黄素效果最显著。见表1。

2.4 大黄素对HUVEC细胞形态和结构的影响

倒置显微镜观察结果显示：与对照组相比，模型组细胞数量明显减少，细胞大分布不均匀，排列稀疏、紊乱，边缘不清晰；与模型组相比，5.0 μmol/L大黄素组细胞数量明显增加，排列紧密，大多保持多边形，形态、结构同对照组接近。Hoechst实验结果显示：对照组HUVEC无凋亡现象，模型组细胞核有明显的核固缩，细胞凋亡增加；5.0 μmol/L大黄素组细胞裂解、染色质固缩的现象有所改善，细胞凋亡明显减少。电镜结果显示：模型组细胞质突起减少，胞质内可见一定量的空泡，细胞器有融合现象；而5.0 μmol/L大黄素组细胞核膜完整，细胞核及核仁明显，空泡减少，胞质内有丰富的细胞器，基本恢复细胞正常形态。见图1。

2.5 大黄素对HUVEC细胞SOD、MDA、NO、NOS水平的影响

模型组SOD、NO、NOS明显低于对照组，MDA水平明显高于对照组(P<0.05);与模型组比较，大黄素各剂量组SOD活力、NO、NOS均显著升高，7.5 μmol/L大黄素组、15.0 μmol/L大黄素组MDA明显降低(P<0.05),见表2。

2.6 大黄素对HUVEC细胞P53、caspase-3、P21蛋白表达的影响

模型组细胞P53、caspase-3和P21蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),与模型组比较，5.0 μmol/L大黄素组P53、caspase-3和P21蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2、表3。

表1 大黄素对细胞增殖的影响

图1 各组HUVEC形态

表2 各组SOD、MDA、NO、NOS水平比较

图2 各组细胞P53、caspase-3和P21蛋白表达

表3 大黄素对P53、caspase-3和P21蛋白表达的影响

3、讨论

HUVEC结构和功能的改变是多种心血管疾病的共同病理基础[11,12],氧化应激是HUVEC损伤及血管内皮功能紊乱的主要诱因，参与内皮细胞病理变化的各个环节，因此预防HUVEC损伤成为防治心脑血管疾病的重要途径。H2O2是目前常用的氧化应激病理模型，它是体内氧化代谢的中间产物，是一种危害很大的氧自由基，可以穿透细胞膜到达细胞内，当积累到一定程度时就会造成HUVEC损伤[13]。本研究结果表明，H2O2通过氧化应激损伤HUVEC的形态和结构；造成细胞抗氧化功能下降，导致抗氧化酶SOD活力降低，脂质过氧化产物MDA生成增多；HUVEC分泌内源性舒张因子NO能力下降。经不同剂量大黄素干预后，SOD酶活力和NO、NOS的水平较模型组显著提升，脂质过氧化产物 MDA的生成显著减少，从而保护HUVEC免受损伤，维持其正常形态结构和功能。

P53蛋白与细胞周期的调控、细胞凋亡、细胞分化、DNA修复等重要的生物学功能有关，是细胞生长周期中的负调节因子；P21和P53共同构成细胞周期G1检查站，是p53最重要的下游基因之一，当细胞受到损伤后，p53作用于p21基因，使其迅速表达，促使细胞凋亡；caspase-3是细胞凋亡的直接执行者，决定了细胞凋亡形态、生物化学改变，caspase-3基因高表达，被认为是启动凋亡和凋亡的一个重要标志。本研究结果表明，H2O2通过激活细胞内P53,进一步活化P21和caspase-3,从而抑制HUVEC增殖并促使其凋亡，导致HUVEC损伤；经大黄素药物干预后，P53/P21/caspase-3蛋白表达较模型组显著降低，从而促进HUVEC增殖，抑制其凋亡。

参考文献:

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