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七叶皂苷钠对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

2023-10-29 87 上传者：管理员

摘要：目的研究七叶皂苷钠对小鼠肾缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用。方法将雄性8周龄的WTC57BL/6小鼠，分为假手术组、模型组和低、高剂量实验组。假手术组充分麻醉后，沿小鼠腹正中线打开腹腔暴露双肾后充分游离双侧肾蒂，并按0.5 mL/10 g剂量注射0.9%NaCl溶液，缝合腹壁(即仅游离而不夹闭双侧肾);模型组实验过程与假手术组相同，但游离双侧肾后，用无损伤微型动脉夹彻底夹闭双肾肾蒂35 min后恢复血流灌注(夹闭双侧肾蒂但不给药);低、高剂量实验组过程与缺血再灌注损伤模型组相同，但需要在缺血35 min后1 h内腹腔注射1、2 mg·kg-1七叶皂苷钠，后续在术后6、12、18 h按时按量分次腹腔注射七叶皂苷钠溶液。术后24 h用全自动生化分析仪检测血清肌酸酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；用试剂盒检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量；在光镜下观察肾组织病理学改变。结果假手术组、模型组和低、高剂量实验组血清Scr分别为(16.36±1.32)、(133.24±8.69)、(111.46±7.18)、(98.32±8.41)μmol·L-1;BUN分别为(7.12±1.02)、(90.77±3.62)、(74.51±2.95)、(52.64±3.30)mmol·L-1;血清TNF-α分别为(1.01±0.04)、(7.37±1.01)、(2.40±0.75)、(2.24±0.73)pg·mL-1;血清IL-10分别为(1.08±0.12)、(7.61±1.73)、(2.25±0.85)、(2.11±0.53)pg·mL-1;血清SOD分别为(160.40±7.69)、(95.43±4.10)、(141.11±5.87)、(138.82±2.28)U·mg-1prot;血清MDA分别为(12.61±1.35)、(17.23±1.55)、(15.11±1.04)、(13.73±0.80)nmol·mg-1prot。与假手术组相比，模型组小鼠血清Scr、BUN、TNF-α、IL-10、MDA水平以及肾病理损伤评分均升高(均P<0.05),SOD水平降低(P<0.05);与模型组相比，低、高剂量实验组小鼠血清Scr、BUN、TNF-ɑ、IL-10、MDA水平均降低(均P<0.05),SOD水平升高(P<0.05)。结论七叶皂苷钠能减轻小鼠肾缺血再灌注损伤，其机制可能与减轻氧化应激和炎症反应有关。

关键词：
七叶皂苷钠
功能破坏
小鼠缺血再灌注损伤模型
急性肾损伤
肾损伤
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肾缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)是指肾血流中断再恢复血液供应导致肾损伤的一种病理生理过程，肾IRI后，肾结构和功能破坏程度逐步加重，甚至会引起一系列不可逆的损伤[1]。肾IRI可诱发炎症因子过表达、氧化应激等而发生急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)[2]。七叶皂苷钠是一类酯键三萜皂苷化合物[3],可以有效减轻氧化应激和炎症介质的释放，从而对缺血再灌注损伤发挥潜在的保护作用；研究发现其对心、肺等器官缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[4]。本研究探讨七叶皂苷钠对小鼠肾IRI的保护作用。

一、材料与方法

1 材料

动物健康SPF级8周龄雄性WTC57BL/6小鼠，体质量(20±2)g,河北北方学院实验室提供。动物使用许可证号：SYXK(冀)2019-004。本实验经河北北方学院伦理委员会批准(伦理批号：S2019-040-01)。

药品与试剂七叶皂苷钠，纯度：总含量≥98%,批号：20977-05-3,北京索莱宝科技有限公司生产。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malon-dialdehyde, MDA)试剂盒，均购自武汉云克隆科技有限公司。

仪器HF240全自动生化分析仪，上海聚慕医疗器械有限公司产品；低温星NX70冰冻切片机，上海赛默飞世尔科技公司产品；DM500显微镜，德国Leica公司产品。

2 实验方法

2.1 模型建立、分组与处理方法[5]5]

动物实验在河北北方学院标准动物实验室进行，恒定室温24～26℃、相对湿度40%～60%且通风良好的标准环境下采用昼夜周期为12 h/12 h的模式下进行，所有实验动物均可自由获取专用的食物和水，符合河北北方学院实验室动物饲养与实验准则。实验前对小鼠适应性饲养1周，小鼠麻醉前6 h禁食，用5%戊巴比妥钠(按50 mg·kg-1)进行腹腔注射麻醉，待小鼠充分麻醉后，依次备皮、消毒。

七叶皂苷钠用0.9%NaCl(七叶皂苷钠20 mg粉末溶于0.9%NaCl溶液500 mL)进行溶解，制成质量浓度为0.04 mg·mL-1的七叶皂苷钠溶液。

用简单随机法将动物分为假手术组、模型组和低、高剂量实验组。假手术组等待小鼠麻醉至无反应状态，依此备皮、消毒，然后用胶带将小鼠充分伸展后固定在手术台上，沿腹正中线依次切开皮肤、腹膜进入小鼠腹腔；用湿润无菌棉签轻轻将肠管推向对侧，找到一侧肾，暴露肾蒂，并充分钝性游离，对侧肾用同样方法游离。并按0.5 mL/10 g剂量腹腔注射0.9%NaCl溶液，缝合腹壁(即仅游离而不夹闭双侧肾蒂)。模型组：实验过程与假手术组相同，但游离双侧肾后，需要用无损伤微型动脉夹彻底夹闭双肾肾蒂35 min后恢复血流灌注(夹闭双侧肾蒂但不给药)。低、高剂量实验组过程与缺血再灌注损伤模型组相同，但需要在缺血35 min后1 h内腹腔注射七叶皂苷钠1、2 mg·kg-1,后续在术后6、12、18 h按时按量分次腹腔注射七叶皂苷钠溶液。

2.2 标本采集和处理

术后24 h经小鼠眼眶内眦静脉丛采取血液0.5～0.75 mL,将采取的小鼠眼眶内眦静脉血室温静置2 h, 4℃下以3 500 r·min-1离心10 min,小心吸取上清液，将血清做好标记并冻存于-80℃冰箱待用。同时再灌注24 h后麻醉下获取双侧肾组织标本，石蜡包埋制备病理切片，以苏木精-伊红(haematoxylin-eosin, HE)染色后观察肾组织病理学改变；部分标本根据需要取肾组织制成10%的组织匀浆待用。

2.3 以全自动生化分析仪检测血清Scr、BUN水平

将小鼠眼内眦静脉取出血后，室温放置2 h后，4℃下以3 500 r·min-1离心10 min, -20℃冰箱保存待用，用全自动生化分析仪检测Scr、BUN水平。

2.4 以试剂盒法检测炎症因子TNF-α、IL-10水平[6]6]

取经充分离心后制备好的10%组织匀浆上清液，用TNF-α及IL-10试剂盒，所有操作步骤均严格按照试剂盒内说明书对TNF-α及IL-10水平进行检测。

2.5 以ELISA法检测肾组织氧化应激产物SOD、MDA含量[7]7]

肾缺血再灌注损伤模型建造后24 h,取肾组织制成10%的组织匀浆，4℃下以3 500 r·min-1离心20 min后，取上清液。严格按照ELISA试剂盒内说明书进行操作，检测氧化应激产物SOD、MDA的含量。

2.6 以HE染色方法观察组织病理形态学变化[8]8]

小鼠肾缺血再灌损伤24 h后，用断颈法处死小鼠，取出肾，置于体积分数为10%中性甲醛溶液中固定，经全自动脱水机完全脱水后，石蜡包埋，制作4μm切片，常规HE染色，显微镜下观察肾小管坏死情况。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用单因素方差分析，2组间比较用LSD-t检验。

二、结果

1 小鼠血清Scr、BUN水平

假手术组仅游离而不夹闭双侧肾；模型组夹闭双侧肾蒂但不给药；低、高剂量实验组缺血再灌注损伤过程中，在缺血35 min后1 h内腹腔注射1、2 mg·kg-1七叶皂苷钠，后续在术后6、12、18 h按时按量分次腹腔注射七叶皂苷钠溶液。

与假手术组相比，模型组血清Scr、BUN水平均升高；与模型组相比，低、高剂量实验组小鼠血清Scr、BUN水平均降低(均P<0.05),见表1。

表1各组小鼠血清Scr、BUN水平

2 小鼠肾组织病理改变

在光学显微镜下，假手术组小鼠肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，无明显炎性细胞浸润；模型组小鼠肾小球不同程度变性、坏死，弥漫性肾小管坏死、管腔扩张；低、高剂量实验组小鼠肾组织损伤均减轻，有不同程度的炎症浸润水肿，肾小球变性坏死情况明显改善。

3 小鼠血清TNF-α、IL-10水平和肾组织SOD水平及MDA含量

与假手术组相比，模型组血清TNF-α、IL-10水平均升高；与模型相比，低、高剂量实验组血清TNF-α、IL-10水平均降低(均P<0.05),见表2。

与假手术组相比，模型组肾组织SOD水平显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05);与模型相比，低、高剂量实验组肾组织SOD水平均显著升高(均P<0.05),MDA含量降低(P<0.05),见表2。

表2各组小鼠血清TNF-α、IL-10、SOD、MDA水平

三、讨论

肾IRI常继发于各种休克、急性中毒、肾移植后，是AKI的常见诱因[9],若未及时救治，可导致慢性肾病的发生，严重影响患者生活质量[10]。本实验选择经腹正中切口以无损伤微型动脉夹夹闭双侧小鼠肾蒂，建立双侧小鼠肾IRI模型，缺血35 min再灌注24 h后，模型组小鼠血清Scr、BUN水平明显升高，病理观察发现肾小管上皮细胞凋亡，肾小管扩张。与模型组比较，低、高剂量实验组小鼠血清Scr、BUN水平明显下降，说明七叶皂苷钠对小鼠肾IRI具有保护作用。

炎症反应和氧化应激是肾IRI的重要原因。肾IRI可导致肾血管内皮细胞释放大量炎症因子，使中性粒细胞在血管内皮附着、浸润、激活，从而加剧炎症反应，出现肾血管收缩、肾小管上皮细胞凋亡，造成肾损伤进一步加重[11]。肾IRI时，中性粒细胞可进入缺血区并被激活，导致肾细胞损伤，而炎症因子TNF-α、IL-10可加速这一进程[12]。TNF-α是引发炎症反应和调节自身免疫的一种炎症因子，能够激活白细胞的黏附分子，加重缺血区的炎症反应，同时TNF-α可促进IL-10等炎症因子的释放。IL-10能通过激活巨噬细胞，使其释放TNF-α,二者相互协同，加重炎症反应。而IL-10是由单核巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞分泌的具有免疫抑制功能的介质，在炎症反应中发挥重要作用[13]。本研究发现，与模型组比较，低、高剂量实验组小鼠血清TNF-α、IL-10水平明显降低，表明七叶皂苷钠对肾IRI的保护作用可能与抑制炎症反应有关。

本研究发现，与模型组比较，低、高剂量实验组小鼠SOD水平升高，MDA水平降低，提示七叶皂苷钠对肾IRI的保护作用可能与减轻氧化应激反应有关。

七叶皂苷钠对小鼠肾IRI起到明确的保护作用，其机制可能与其抗炎、抗氧化作用相关。

参考文献:

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