骨关节炎(osteoarthritis, OA)是由衰老、肥胖、机械损伤等多种因素引起的以关节疼痛、肿胀、晨僵及运动障碍等为主要表现的退行性关节性疾病。我国OA整体患病率约15%[1],且呈逐年上升趋势，给患者及社会造成沉重负担。目前西医多采用非甾体类抗炎药、阿片类镇痛药、软骨保护类药物等对症治疗OA,能缓解症状，但药物不良反应明显。中医将OA归为“骨痹”“痹症”等范畴，积累了丰富临床治疗经验。研究发现，OA的治疗与补肝肾密切相关，而活血化瘀药的使用贯穿OA治疗的始终[2],可见补肾活血是中医治疗OA的主要疗法之一。牛膝有补肝肾、强筋骨、活血祛瘀的功效，属中医通过补肾活血法治疗OA的常用中药[3]。本文通过对牛膝及其活性成分在OA治疗中的作用及可能的机制进行综述，为OA新药研发提供新的方向和依据。

1、牛膝及其活性成分治疗OA的作用机制

牛膝及其活性成分抑制OA炎性因子的产生和软骨细胞凋亡。OA的症状及体征就是慢性炎症反应，多种炎性因子能加速分解代谢、促进破坏性过程，打破关节组织代谢平衡，还能促进其他炎性物质、酶类等产生，损害软骨细胞生理功能，促进OA进展。刘加钱等[4]用牛膝煎煮液灌胃治疗OA大鼠，结果发现，OA大鼠关节液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、IL(interleukin, IL)-1β水平均明显降低，Makin评分明显降低，表明牛膝可以抑制炎性因子产生，减轻OA症状。软骨丢失是OA发病的主要机制，而软骨细胞凋亡是导致软骨丢失、破坏的重要原因。研究发现，牛膝醇提物能通过降低凋亡促进因子软骨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1、凋亡关键执行分子胱天蛋白酶3(caspase-3)表达，上调抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B celllymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)与促凋亡单蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)比值，抑制软骨细胞凋亡，实现软骨细胞增殖，促进软骨损伤修复[5]。

牛膝及其活性成分减轻OA的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解和氧化应激反应。软骨ECM主要成分为Ⅱ型胶原(collagenⅡ)、聚集蛋白聚糖、透明质酸等，能维持软骨细胞正常代谢和功能。ECM降解增加、合成减少是OA的重要特征之一，其与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)异常表达有关，作为胶原蛋白水解酶，MMPs可降解ECM的所有成分，是OA治疗的作用靶点。研究发现，怀牛膝灌胃能使OA模型病灶侧滑膜组织中MMP-3、MMP-13表达下降，金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP1)表达增加，防治OA;牛膝醇提物则能提高CollagenⅡ表达，促进软骨ECM成分恢复，加速软骨损伤修复，改善关节黏连[6]。软骨细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)在正常情况下能调节软骨细胞凋亡、调节ECM合成、分解，以维持软骨稳态，而ROS过量累积则可引发氧化应激，损伤软骨细胞，诱发软骨ECM降解，导致OA发生。怀牛膝可通过降低膝关节OA关节液中一氧化氮合酶含量，增加ROS清除剂超氧化物歧化酶活性，来保护软骨组织，延缓OA病情发展。

2、牛膝及其活性成分治疗OA的信号通路

牛膝及其活性成分治疗OA的相关的信号通路主要有3条：一是核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路。NF-κB是常见的转录因子，接触刺激后可进入细胞核内与相应的NF-κB反应元件结合，促进炎性因子、趋化因子等表达，参与滑膜炎症、软骨细胞分解代谢及软骨细胞存活等OA的发病环节[7]。任立桐等[8]将大鼠分为对照组、模型组及牛膝总皂苷低、中、高剂量组，灌胃治疗后发现，牛膝总皂苷各剂量组关节肿胀度均较模型组下降，miR-19表达升高，NF-κB及其靶基因SOX9表达降低，且呈剂量依赖性，提示牛膝总皂苷能通过抑制NF-κB通路，减轻OA炎症症状。二是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路。MAPK信号通路中的p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路与OA有关，异常激活后主要参与OA的软骨细胞损伤、软骨细胞凋亡、促进MMPs产生等过程。周叶等[9]研究认为，牛膝多糖能通过激活抗凋亡基因NAMPT、Sirt1,下调p38信号通路下游凋亡基因p53、Bax表达，保护硝普钠诱导的兔软骨细胞凋亡。马笃军等[10]研究发现，牛膝醇提物可通过促进AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)蛋白表达，抑制ERK、JNK、p38、环氧化物酶-2、β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达，来调控AMPK/Wnt/MAPK信号通路，改善兔OA模型病理评分。三是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路。在OA中，PI3K/AKT信号通路主要参与调控软骨细胞凋亡和关节软骨内稳态[11]。李淑洁等[12]研究显示，牛膝提取物可促进碘乙酸钠诱导的软骨细胞中的AKT磷酸化，可能通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制软骨细胞Caspase-3活性，上调Bcl-2表达，抑制软骨细胞凋亡，发挥软骨细胞活力保护作用。

3、牛膝及其活性成分治疗OA的相关研究

牛膝为临床常用饮片，有补肝肾、强筋骨、活血通经、引火下行之效。《本经》道，牛膝“主寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈”;《滇南本草》称其能“止筋骨疼，强筋舒筋，止腰膝酸麻”。药理研究发现，牛膝有抗炎镇痛、抗骨质疏松、免疫调节、抗衰老等作用，在OA治疗方面疗效较好[13]。毛燕飞等[14]将牛膝醇提液通过定向透药疗法导入膝OA患者膝关节内，结果显示，观察组(牛膝醇提液)和对照组(常规护理)的膝关节功能评分分别为(78.23±8.22)和(68.14±10.29)分，西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎评分分别为(20.31±2.28)和(31.29±3.69)分，这说明牛膝醇提液能有效提高患者的膝关节功能，改善治疗效果。柯晖等[6]对兔膝关节OA模型分别灌服低、中、高剂量怀牛膝和西乐葆，6周后发现，怀牛膝能够降低滑膜组织MMP-3、MMP-13表达，提高滑膜TIMP1水平，发挥治疗OA作用。牛膝含药血清在体外能通过抑制P38 MAPK信号通路，保护OA软骨细胞，效果与P38阻断剂SB203580相当。查阅文献可知，牛膝中皂苷类、多糖类、植物甾酮类等多种活性成分[15]均在OA治疗中发挥着积极作用。

3.1 牛膝总皂苷

牛膝总皂苷以齐墩果酸型三萜皂苷为主，药理作用包括抗炎、抗凋亡、抗氧化等。余阗等[16]采用牛膝总皂苷灌胃对兔OA模型进行干预，结果发现，正常组、OA模型阳性对照组、空白组和牛膝总皂苷高、中、低剂量组的关节黏连改善度分别为89.24±4.12、80.34±5.06、68.15±4.23、88.13±4.85、86.11±5.30和75.51±5.34,滑膜炎Krenn评分分别为(0.18±0.23)、(5.02±1.61)、(7.36±1.49)、(2.53±1.12)、(4.83±1.26)和(5.62±1.07)分，可见牛膝总皂苷能使兔OA模型的关节黏连改善度增加，滑膜炎Krenn评分降低，其作用可能与抑制滑膜组织β-catenin表达以及降低关节液中TNF-α、IL-1β、MMP-3含量有关。高坤等[17]研究也发现，牛膝总皂苷能缓解OA兔膝关节活动度，并使关节滑膜液内炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-10、TNF-α)、趋化因子(CCL3、CXCL8、CXCL9)以及基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3)等含量降低，减轻炎症和软骨损伤。软骨细胞为软骨的唯一细胞，OA患者存在软骨细胞凋亡及关节软骨破坏，保护软骨细胞在OA治疗中有关键作用。陈浩雄等[18,19]将人膝OA软骨细胞分为牛膝总皂苷0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg·mL-1组进行干预，3 d后发现，0.5 mg·mL-1组的细胞增殖光密度(optical density, OD)值最高、总凋亡率最低[(3.9±0.5)%]、CollagenⅡmRNA表达上调最明显，IL-1β和TNF-α[(8.13±0.11)、(13.25±1.71)pg·mL-1]水平也明显降低，表明牛膝总皂苷可通过减轻炎症、促进软骨细胞增殖、抑制软骨细胞凋亡等对OA发挥治疗作用。

3.2 牛膝多糖

牛膝多糖是从牛膝中提取的一种水溶性寡糖，由果糖和葡萄糖按8∶1的比例组成，糖链中还含有多种果糖残基，这些单糖可以作为重要底物参与软骨细胞糖胺多糖的合成，影响软骨细胞分化及承重能力，另外，牛膝多糖还具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等药理活性。在OA领域中，邹来勇等[20]通过改良Huhh法建立兔膝关节OA模型，分为治疗组(2 g·kg-1牛膝多糖)和对照组(2 mL·kg-1 0.9%NaCl),结果发现，治疗组和对照组软骨下骨中骨桥蛋白含量分别为(3 210.28±316.78)和(3 585.44±436.96)ng·L-1,关节滑液中骨桥蛋白含量分别为(700.2±204.5)和(890.4±214.4)ng·L-1,提示牛膝多糖能降低炎性细胞因子骨桥蛋白的含量，有效促进OA修复。FU等[21]用改良Hulth法复制OA大鼠，分为正常组(10 mL·kg-1 0.9%NaCl)、模型组(10 mL·kg-1 0.9%NaCl)和牛膝多糖组(400 mg·kg-1牛膝多糖),治疗8周后发现，与模型组相比，牛膝多糖组大鼠的改良Wakitani病理评分明显降低，软骨组织MMP-9、MMP-13表达水平均明显降低，TIMP-1、TIMP-3及CollagenⅡ 表达水平均明显升高，ECM状态改善；之后提取OA大鼠的关节软骨细胞，经IL-1β处理后沉默细胞中的中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)生长停滞特异性转录物5,分为对照组、IL-1β组、牛膝多糖组进行干预，结果发现，牛膝多糖可逆转IL-1β引起的软骨细胞中lncRNA GAS5表达升高，进而降低MMP-9、MMP-13表达，上调TIMP-1、TIMP-3表达，该研究表明，牛膝多糖能够通过抑制lncRNA GAS5的表达，来调节ECM的稳态，延缓OA期间软骨退化的发生。另一项类似研究认为，牛膝多糖可能通过调节lncRNA核内富集转录物1/miR-377-3p轴，降低OA小鼠软骨组织中，蛋白激酶R样内质网激酶、免疫球蛋白重链结合蛋白、转录激活因子4、C/EBP同源蛋白、IL-6、TNF-α、细胞核因子KP65蛋白含量，抑制软骨细胞的内质网应激(endoplasmic retieulum stress, ERS),减少OA相关的软骨细胞凋亡，促进OA线束关节软骨修复[22]。牛膝多糖还能通过上调细胞周期蛋白D1以及细胞周期蛋白依赖性激酶(cycling-dependented kinase, CDK)4、CDK6表达，促进G1/S细胞周期转换，来加速软骨细胞增殖。可见，牛膝多糖对改善OA血液循环、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨细胞增殖、抑制ERS、抑制软骨基质降解有较好疗效。

3.3 植物甾酮类成分

牛膝中的植物甾酮类成分主要包括蜕皮甾酮、β-蜕皮甾酮等，蜕皮甾酮属于植物雌激素的一种，可以发挥雌激素样作用，能够抗脂质过氧化、促进蛋白合成等。王刚涛等[23]将兔关节软骨细胞分为空白组、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)组和蜕皮甾酮干预组(LPS+蜕皮甾酮)进行相应干预，发现蜕皮甾酮干预组的细胞增殖率明显高于LPS组(0.65±0.04 vs 0.22±0.03),凋亡率及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达量(1.57±0.37 vs 2.32±0.24)、一氧化氮(nitric oxide, NO)[(15.23±2.56) vs (21.87±3.06)μmol·L-1)]、细胞因子IL-1β含量[(80.65±6.69)vs(143.69±8.67)]μmol·L-1均显著低于LPS组，提示蜕皮甾酮可能通过抑制iNOS表达来促进软骨细胞增殖并抑制其凋亡，保护软骨细胞损伤。汤样华[24]将C57小鼠分为假手术组(假手术+0.9%NaCl皮下注射)、模型组(OA造模手术+0.9%NaCl皮下注射)和实验组(OA造模手术+5 mg·kg-1β-蜕皮甾酮皮下注射),干预2个月后发现，实验组的MMP-13(1.22±0.04 vs 1.87±0.03)、Collagen X(1.61±0.10 vs 2.92±0.21)、骨钙素(1.19±0.02 vs 1.72±0.03)基因表达水平均显著低于模型组，关节软骨组织形态明显改善，表明β-蜕皮甾酮可能调控关节软骨组织中MMP-13、CollagenⅩ以及骨钙素等基因表达来延缓膝OA小鼠关节软骨退变；其又在体外采用β-蜕皮甾酮处理IL-1β诱导的软骨细胞，结果发现，β-蜕皮甾酮能逆转IL-1β引起的软骨细胞CollagenⅡ下降及MMP-13、MMP-9升高，表明β-蜕皮甾酮可能通过影响软骨细胞胶原(CollagenⅡ)及MMP-13、MMP-9的表达，来抑制软骨基质降解，延缓软骨细胞退变[25]。TANG等[26]分别采用3-甲基腺嘌呤、西罗莫司和不同剂量β-蜕皮甾酮处理OA大鼠模型及其分离出的软骨细胞，结果发现，大剂量β-蜕皮甾酮组软骨细胞caspase-3表达水平及凋亡率最低，自噬相关蛋白Atg7、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平最高，PI3K、p-AKT1、p-哺乳动物西罗莫司靶点(mammalian target of rapamycin, mTOR)和p-p70核糖体蛋白S6激酶水平最低，软骨组织和软骨细胞中IL-1β、IL-6、NO和TNF-α 浓度最低，表明β-蜕皮甾酮可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路来激活软骨细胞自噬，进而减轻OA。国外有研究发现[27],在体内和体外模型中，β-蜕皮甾酮能够抑制胶原酶诱发的OA小鼠促炎细胞因子产生，减轻蛋白多糖的降解和骨小梁的丢失，还能上调小鼠股骨和IL-1β 刺激的软骨细胞中叉头框蛋白O1(nuclear forkhead box O1,FOXO1)表达，进而抑制血小板反应蛋白解整合素金属肽酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTS)-4和ADAMTS-5的解联素样金属肽酶转录和翻译，表明β-蜕皮甾酮可能通过调控FOXO1/ADAMTS-4/5信号轴，来抑制胶原酶诱导的OA小鼠模型的软骨细胞凋亡，减轻软骨损伤。可见，牛膝中的植物甾酮类成分在抗软骨细胞凋亡、抑制软骨基质降解、激活软骨细胞自噬、抗炎等方面的效果较好，具有治疗OA的潜在价值。

4、讨论

牛膝是治疗OA的常用中药，一般以复方的形式应用于OA的临床防治，并取得了不错的疗效。但是，基于中药有效活性成分的多样性、复杂性以及作用的多靶点性、多效应性，牛膝的药效物质基础和具体的作用机制还未明确，这就限制了其在临床更为广泛的运用。因此，明确牛膝中的有效活性成分及相关作用机制，可为深入了解并应用牛膝治疗OA提供重要的参考依据。本文通过查阅、分析近十余年来的相关文献，发现在OA治疗领域，研究较多的牛膝活性成分主要为牛膝皂苷、牛膝多糖和植物甾酮类成分(蜕皮甾酮、β-蜕皮甾酮);这些活性成分主要通过NF-κB、MAPK、PI3K/AKT等信号通路，来抑制炎性因子产生、调节软骨细胞代谢、减少ECM降解、抗氧化应激等，干预OA进展，在OA治疗方面有潜在应用价值。但是，目前的相关研究中牛膝的活性成分的种类及数量较为局限，且大部分研究为体外实验、动物实验，临床观察不足。未来可结合网络药理学技术，筛选更多的有效活性成分，同时增加临床试验依据，更深入地揭示牛膝治疗OA的潜在活性成分和作用机制，为相关的OA治疗新药研发提供依据。

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文章来源:郑曲,张宇,杨永菊等.牛膝及其活性成分治疗骨关节炎的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2023,39(20):3032-3036.