鳖甲，作为常用动物药，始载于汉代《神农本草经》，列为中品，历代本草都有记载。2020年版《中华人民共和国药典》规定鳖甲来源鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲[1](Trionyx sinensis也称为Pelodiscus sinensis[2])。其甲具有滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结等功效，常用于阴虚发热，骨蒸劳热，阴虚阳亢，头晕目眩，虚风内动，手足瘈疭等症。随着养殖业和国际贸易的发展，鳖甲的商品药材来源逐渐复杂，现市场上主要以同属和其混伪品作为鳖甲药用情况较为普遍，如龟甲(Chinemys reevesii (Gray))、角鳖(Apalone spinifera)、佛罗里达鳖(Apalone ferox)、山瑞鳖(Trionyx(又称马来鳖，Dogania subplana)、鼋(Pelochelys bibroni)、巨鳖(Trionyx gangeticus)、非洲鳖(Trionyx triunguis)等。传统鉴定方法主要根据药材的性状、组织结构等形态学特征[3]，但中华鳖与其混伪品的性状接近，形态相似，依靠传统的鉴别方法难度较大，受主观影响程度较大，准确性降低，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成中药配方颗粒后，药材失去原有性状，水提取物和配方颗粒失去显微特征，使得其基原更加难以进行有效的鉴别，急需建立鳖甲配方颗粒客观准确、科学合理、快速便捷的检测方法[4]，保障鳖甲配方颗粒质量标准控制、临床用药的安全性和有效性。

近年来，由于分子生物学技术具有特异性高、稳定性好、不受主观因素影响等特点，已广泛应用于中药的基原鉴定，如位点特异性PCR[5]、实时荧光定量PCR[6]、限制性片段长度多态性PCR[7]、高分辨熔解曲线技术[8]等。目前，已有关于鳖甲特异性PCR鉴别方法的报道。程素倩等人通过单核苷酸多态性位点设计了特异性鉴别引物，并对PCR反应条件进行优化，鳖甲药材、饮片及醋鳖甲均扩增获得约300 bp的特异性条带，且混伪品无条带[9]。刘忠权等人基于12S rRNA基因设计了能鉴别鳖甲药材及伪品山瑞鳖、斑鳖的特异性引物，通过PCR技术鳖甲药材扩增出约170 bp的单一条带，伪品无条带，其扩增结果与DNA序列分析一致[10]。杜鹤等人基于DNA条形码技术，构建中华鳖及其混伪品的NJ(邻接)系统聚类树，发现中华鳖种内COI序列变异很小，种间存在较多的变异位点，种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离，可以很好地鉴定鳖甲及其混伪品[11]。吴平等人从中华鳖和混伪品原动物组织中提取DNA，通过PCR扩增获得线粒体12S rRNA基因片段并测序，发现中华鳖与其他鳖科动物DNA序列存在明显差异[12]。对蒸制药材，刘中权等人通过长时间脱钙处理，从蒸制鳖甲药材中提取总DNA并扩增出12S rRNA片段[13]。然而，以上研究仅限于鳖甲药材、饮片或原动物材料，关于鳖甲配方颗粒的分子鉴定鲜有报道。此外，对于经过高温提取、干燥等加工而成的鳖甲配方颗粒，DNA严重降解，常规DNA提取方法和PCR扩增可能不适用于鳖甲配方颗粒的DNA分子鉴定。本研究利用位点特异性PCR技术对鳖甲基原药材、标准汤剂冻干粉和配方颗粒进行鉴定，分析其适用性，建为中药配方颗粒的质量控制和用药安全提供理论基础和保障。

1、仪器与材料

1.1 材料

鳖甲药材来自湖北、安徽、江苏等地，见表1，鳖甲药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲，样品保存于广东一方制药有限公司标本中心。以鉴定准确的鳖甲药材制备了7批冻干粉、3批配方颗粒成品，具体样品信息见表2。另从不同药材市场购买了4种较为常见的鳖甲伪品品种，包括乌龟2批、角鳖2批、佛罗里达鳖2批和山瑞鳖1批，共4个品种7批药材，具体样品信息见表3。  

表1 鳖甲药材信息   

表2 鳖甲标准汤剂冻干粉、配方颗粒成品信息  

表3 市售鳖甲伪品药材信息  

1.2 仪器

T100 Thermal Cycler型PCR仪(美国伯乐生命科技有限公司)，StepOne Real-time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，Syngene Nu Genius凝胶成像仪(美国Syngene公司)，Owl Easy Cast电泳仪(赛默飞世尔科技公司)，BioSpec-nano紫外分光光度计(岛津公司)。

1.3 仪器

MightyAMP DNA聚合酶、TaKaRa Taq DNA聚合酶、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、SpeedSTAR HS DNA聚合酶、DL500 DNA Marker均购自大连TaKaRa公司，蛋白酶K(天根生化科技(北京)有限公司)。

2、方法

2.1 DNA提取

鳖甲药材及其混伪品使用SDS法提取DNA。所有样品均经过75%乙醇清洗表面，晾干后使用研磨仪进行粉碎。取100 mg鳖甲药材置2 mL离心管，加入已预热的SDS裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl pH=8.0,200 mmol·L-1 NaCl,250 mmol·L-1 EDTA pH=8.0,1%SDS)1.0 mL、蛋白酶K(20 mg·mL-1)10μL，混匀，56℃水浴过夜；加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)溶液，混匀，12000 r·min-1离心10 min，吸取上清液置另一离心管中，再同法操作2次；吸取上清液另一离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃冰箱静置1 h;12000 r·min-1离心5 min，弃上清液；沉淀加入75%乙醇700μL,12000 r·min-1离心5 min，弃上清液，再同法操作2次；加入无水乙醇700μL,12000 r·min-1离心5 min，弃上清液；置37℃下挥干溶剂，加灭菌水50μL使溶解，-20℃保存。

鳖甲标准汤剂冻干粉和配方颗粒使用两步CTAB法提取DNA。取100 mg鳖甲标准汤剂冻干粉或配方颗粒粉末，置2.0 mL离心管，加入CTAB沉淀液(2%CTAB,100 mmol·L-1 Tris-HCl pH=8.0,20 mmol·L-1 EDTA pH=8.0)1.2 mL，混匀，65℃水浴1 h，中间颠倒混匀5～6次；12000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入CTAB沉淀液1.2 mL，混匀，65℃水浴30 min，中间颠倒混匀5～6次；12000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入CTAB提取液(2%CTAB,100 mmol·L-1 Tris-HCl pH=8.0,20 mmol·L-1 EDTA pH=8.0,2.5 mol·L-1 NaCl,2%PVP40)1.0 mL、蛋白酶K(20 mg·mL-1)10μL和β-巯基乙醇10μL，混匀，65℃水浴过夜；自“加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)溶液”同法操作，最后加灭菌水20μL使溶解，-20℃保存。

2.2 引物设计

从Genbank中下载鳖、乌龟、佛罗里达鳖、角鳖和山瑞鳖的动物细胞色素C氧化酶亚基1(CO I)序列，使用BioEdit软件进行比对，发现第289位(以鳖的序列JF700186.1为参照序列)中华鳖的位点为C而其他相近物种为A或T，确定该SNP位点后，使SNP位点接近正向引物3’端，借助Primer Premier5软件设计，通过最终引物评分以确定最佳组合，设计鉴别引物上游：5'-CTACCCCCCTCATTACTACTTCTC-3'和下游：5'-ACGGGAGTTTGGTATTGT GA-3'。经特异性PCR扩增后，扩增产物长度为236 bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.3 PCR反应条件的建立与优化

用设计的鳖甲特异性引物BJ-5F和BJ-5R进行PCR反应，反应体系为25μL，包括10×PCR buffer 2.5μL,dNTP 2.0μL，正反引物(10μmol·L-1)各0.3μL,rTaq酶(5 U/μL)0.2μL,DNA模板0.5μL,ddH2O 19.2μL。PCR反应参数：95℃、5 min;95℃、30 s,60℃、30 s,72℃、30 s,33个循环；72℃、5 min;4℃结束。取PCR产物8μL，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳、染色，凝胶成像系统进行观察。为获得最佳PCR鉴别条件，本研究对退火温度、Taq酶种类、引物量、Taq酶浓度、循环数和PCR仪器种类进行考察。确定最优PCR反应条件后，对鳖甲药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒及其混伪品进行适用性考察。

2.4 测序验证与分析

随机选取3批鳖甲药材、标准汤剂和配方颗粒，根据以上确定的鳖甲特异性PCR鉴别条件进行扩增，扩增产物送往生工生物(上海)有限公司进行双向测序，测序峰图利用BioEdit软件进行拼接并手工矫正，去除引物区段，分别在NCBI和全球药典基因组数据库(Global Pharmacopoeia Genome Database,GP Genome DB)上进行BLAST分析，验证鳖甲特异性引物扩增的产物是否为中华鳖。

3、结果与分析

3.1 DNA提取

使用SDS法提取的鳖甲药材DNA质量浓度均值为286.44,A260/A280均值为1.97；使用两步CTAB法提取的鳖甲冻干粉和颗粒DNA质量浓度均值分别为213.65和233.26,A260/A280均值分别为1.88和1.96，说明了该两种方法获得DNA质量较好，可用于鳖甲药材、标准汤剂和配方颗粒的DNA提取。

3.2 PCR条件优化

旨在建立准确可靠的鳖甲配方颗粒及其混伪品特异性PCR鉴别方法，本文对鳖甲特异性鉴别引物BJ-5F和BJ-5R在PCR反应条件中进行了考察与优化。对退化温度进行考察，从图1可知，退火温度为59、60、61、62℃时，鳖甲药材、标准汤剂冻干粉和配方颗粒均可扩增出约236 bp目的条带，且混伪品和阴性对照均无假阳性出现。但随着温度的增加，目的条带质量逐渐减弱，为保证条带质量，故选用退火温度为60℃。

图1 退火温度对鳖甲配方颗粒鉴别结果的影响   

对Taq DNA聚合酶种类进行考察，从图2可知，DNA聚合酶为rTaq、Ex Taq、SpeedSTAR HS和Mighty AMP时，鳖甲样品都可在约236 bp处获得有效扩增，但Mighty AMP和Speed STAR HS均能扩增出角鳖、佛罗里达鳖和山瑞鳖，rTaq和Ex Taq均未对混伪品进行扩增，为保证结果准确性和稳定性，可选用rTaq或Ex Taq酶作为DNA聚合酶，本研究选用rTaq作为DNA聚合酶。

图2 Taq酶种类对鳖甲配方颗粒鉴别结果的影响   

对Taq酶用量进行考察，从图3可见，rTaq酶量为0.2μL、0.3μL、0.4μL时，鳖甲药材、标准汤剂冻干粉和配方颗粒均能有效地扩增出约236 bp目的条带，且混伪品和阴性对照均无假阳性出现，而rTaq酶量为0.2μL时，目的条带亮度适中，引物二聚体不明显，故选择rTaq酶量为0.2μL。

图3 rTaq酶用量对鳖甲配方颗粒鉴别结果的影响   

对PCR循环数进行考察，从图4可以看出，循环数为29、33、37、40个时，鳖甲药材、标准汤剂冻干粉和配方颗粒均能有效地扩增出约236 bp目的条带，混伪品和阴性对照均无假阳性出现。而循环数为33个时，目的条带较为明亮，引物二聚体不明显，故选择PCR循环数为33个。

图4 循环数对鳖甲配方颗粒鉴别结果的影响   

对PCR反应体系中的引物量进行考察，从图5可知，引物量为0.2、0.3、0.4、0.5μL时，鳖甲药材、标准汤剂冻干粉和配方颗粒均能有效扩增出约236 bp目的条带，且混伪品和阴性对照无假阳性出现。而当引物量为0.3μL时，目的条带较为明亮，引物二聚体不明显，故选择引物量为0.3μL。

图5 循环数对鳖甲配方颗粒鉴别结果的影响   

对PCR仪种类进行考察，分别使用T100 Thermal Cycler型PCR仪和StepOne Real-time PCR仪进行试验，从图6可见，使用T100 Thermal Cycler型PCR仪和StepOne Real-time PCR仪进行试验时，2个品牌的PCR仪均可获得正确的鉴定结果，且不同PCR仪之间目的条带差异较小，说明该方法的耐用性良好。

图6 PCR仪种类对鳖甲配方颗粒鉴别结果的影响   

根据以上考察结果，确定鳖甲配方颗粒特异性PCR反应体系和条件，反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP 2.0μL，正反向引物(10μmol·L-1)各0.3μL,rTaq DNA聚合酶0.2μL,DNA模板0.5μL,ddH2O 19.2μL。PCR反应参数为95℃、5 min;95℃、30 s,60℃、30 s,72℃、30 s,33个循环；72℃、5 min;4℃结束。

3.3 鳖甲检出限分析

对鳖甲药材、配方颗粒模板DNA进行浓度梯度稀释，分别稀释10、100、1000倍，并对其进行特异性PCR扩增。从图7可知，鳖甲目的条带的亮度随着DNA浓度降低而减弱，当鳖甲药材DNA浓度在120～0.12 ng·μL-1时均能有效扩增出目的条带，而当鳖甲配方颗粒DNA浓度低于0.26 ng·μL-1时，不能进行有效的特异性扩增，表明了鳖甲配方颗粒特异性PCR鉴别最低检出限为0.26 ng·μL-1。

图7 不同模板DNA浓度位点特异性PCR扩增   

3.4 鳖甲适用性考察

根据最终确定的最优PCR反应条件，选择鳖甲药材16批、鳖甲标准汤剂冻干粉7批、鳖甲配方颗粒成品3批、龟甲2批、角鳖2批、佛罗里达鳖2批和山瑞鳖1批进行PCR鉴定，结果如图8所示，鳖甲对照药材和所有鳖甲样品均能有效扩增出约236 bp目的条带，而混伪品和阴性对照均无条带。表明了本研究设计的特异性引物和建立的特异性PCR方法能适用于鳖甲原料、标准汤剂和配方颗粒的特异性鉴别。

图8 鳖甲及其混伪品的特异性PCR鉴别   

3.5 鳖甲测序验证结果

随机选取鳖甲药材、标准汤剂和配方颗粒样本各3批进行特异性PCR扩增，所测定样本的测序信息见表4。序列经过NCBI和GP Genome DB比对，发现9批鳖甲样本的特异性扩增产物的比对结果均为中华鳖Pelodiscus sinensis，其序列相似度在98.97%～100%，表明了鳖甲特异性引物BJ-5F和BJ-5R可用于鳖甲药材、标准汤剂和配方颗粒的真伪鉴定。 

表4 鳖甲样品测序验证信息 

4、讨论

中药配方颗粒是由单味中药饮片为原料，按照传统标准炮制后经提取浓缩制成的供中医临床配方用的颗粒，已经完全失去原药材的特征性状，传统鉴别手段难以对其进行客观真实的鉴定，给中药配方颗粒质量控制和用药安全带来极大隐患，急需一种能够安全快速、客观真实的检测技术对其进行质量控制。基于SNP位点的位点特异性PCR技术近年来广泛应用于中药真伪鉴别，该技术只需利用PCR反应即可准确、快速、客观地鉴别中药材基原真伪。有研究表明，经过长时间熬煮提取会使得动植物DNA降解严重，其DNA降解程度与古DNA样本相似，片段长度难以存留超过200 bp[14,15]。本研究采用两步CTAB法成功提取鳖甲配方颗粒和标准汤剂冻干粉DNA，证明了经过长时间煮沸提取、干燥、制粒等工序而成的中药配方颗粒中，仍存留一定量的DNA短片段，可用于特异性PCR技术进行基原鉴别。然而，不同品种的中药材其性质也不同，导致其配方颗粒的加工工序如提取时间、辅料量、干燥方式等均有所不同，应遵循中药分子鉴定使用原则[16]，选择适宜的DNA提取方法，获得高质量的DNA片段，为后续特异性PCR鉴别奠定质量基础。本文基于位点特异性PCR技术，建立了一种鳖甲配方颗粒快速鉴别方法，不仅为其他品种配方颗粒的鉴别手段提供理论参考，同时也为中药配方颗粒质量控制标准的建立和完善、临床用药提供了安全保障。

参考文献:

[1]中国药典[S].一部,2020.

[2]张孟闻,宗榆,马积藩.中国动物志[M].北京:科学出版社,1998.

[3]李军德,徐海宁,赵丽云,等.鳖甲的生药学研究[J].中国中药杂志,1996,(09):6-10+62.

[4]胡力,赵玉洋,袁媛,等.地龙(参环毛蚓)配方颗粒的位点特异性PCR鉴别[J].中国实验方剂学杂质,2022,28(17):119-126.

[5]陈梓媛,赵玉洋,谢旭桃,等.多基原九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(17):106-112.

[6]曹际娟,卢行安,秦成,等.实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技术通讯,2002,13(2):158-160.

[7]孙丽媛,李盈诺,陈思秀,等.中药材川贝母聚合酶链式反应法-限制性片段长度多态性分析的鉴别及应用研究[J].中国药学杂志,2018,53(23):1992-1998.

[8]张雪艳,袁媛,胡启跳,等.龟甲的特异性PCR及高分辨率熔解曲线技术鉴别方法研究[J].中国现代中药,2019,21(9):1215-1220.

[9]程素倩,袁媛,刘富艳,等.特异性PCR方法鉴别鳖甲药材和饮片[J].中国中药杂志,2018,43(23):4569-4574.

[10]刘忠权,王义权,周开亚.中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究[J].中草药,2001,32(8):736-738.

[11]杜鹤,崔丽娜,张辉,等.鳖甲及其混伪品的DNA分子鉴定[J].世界科学技术(中医药现代化),2011,13(2):429-434.

[12]吴平,周开亚,徐珞珊,等.用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲[J].中国药科大学学报,1998,29(1):28-30.

基金资助:国家自然科学基金项目(81872832,82173781);广东省基础与应用基础研究基金项目(2020B1515120033);广东省教育厅重点领域专项(2020ZDZX2057);佛山市岭南道地药材分子鉴定工程技术研究中心支持项目(佛科[2017]203号);广东省岭南中药全过程质量控制与精准分析工程技术研究中心支持项目(粤科函产字[2023]172号);

文章来源:谭斯尹,宋叶,范耀耀等.鳖甲配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究[J].广东化工,2024,51(04):133-138.