炙黄芪为黄芪的蜜炙炮制加工品[1]。在黄芪众多炮制品中，炙黄芪的临床应用最为广泛，化学成分主要为黄酮类、皂苷类、多糖类[2]等，具有抗氧化[3]、抗炎[4]、免疫调节[5-6]、抗动脉粥样硬化[7]等活性。已有文献及课题组研究表明，黄芪在过热条件下提取，其丙二酰基类成分会发生转化[8-9]。在蜜炙过程中，生黄芪中丙二酰异黄酮苷会转化为相应的乙酰异黄酮苷及相关的异黄酮苷，丙二酰环黄芪醇皂苷仅转化为乙酰环黄芪醇皂苷[10]，转化后的乙酰基成分为炙黄芪特征成分。有研究表明，黄芪蜜炙后免疫调节活性增强[11-13]，蜜炙引起的化学成分的转化可能是产生此活性差异的重要物质基础。然而，现有炙黄芪的质量控制标准与黄芪基本一致，具体表现在含量测定指标与样品制备方法上[1]，主要聚焦于部分异黄酮类成分的含量测定及多组分指纹图谱[14-15]，而忽视了其中经蜜炙转化的乙酰基类成分。中药具有多成分、多靶点的复杂特性，药典中仅以2种成分对炙黄芪进行质量评价已不能满足质量控制的要求。鉴于对照品制备相对困难，采用一测多评（quantitative determination analysis multicomponent by a single-marker,QAMS）法可以实现多成分质量评价，具有很高的适用性[16-17]。

本研究基于黄芪蜜炙后化学成分的转化，考虑其主要指标成分及特征乙酰基成分，以毛蕊异黄酮7-O-β-D-葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside,CYG）、黄芪皂苷I(astragaloside I,AGI）分别为6种异黄酮和2种三萜皂苷的内参物，建立高效液相色谱仪-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器（HPLC-PDA-ELSD）联用测定炙黄芪中CYG、乙酰毛蕊异黄酮苷（calycosin-7-O-glucoside-6ʺ-O-acetyl,CYA）、芒柄花苷（formononetin-7-O-glucoside,FMG）、毛蕊异黄酮（calycosin,CY）、乙酰芒柄花苷（formononetin-7-O-glucoside-6ʺ-O-acetyl,FMA）、芒柄花素（formononetin,FM）、AGI、乙酰黄芪皂苷I(acetylastragaloside I,ATI)8种成分的分析方法，并建立炙黄芪6种异黄酮的QAMS质量控制方法。该法检测成本低、耐用性强、准确性高，为炙黄芪的质量控制提供依据。

1、仪器与试剂

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪、2998 PDA检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；Altech/2000ES分析型蒸发光散射检测器、Allchrom model 6000蒸发光散射检测器（美国Altech公司），空气发生器（天津市津分分析仪器制造有限公司）；色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm):Hedera ODS-2 C18（江苏汉邦科技股份有限公司）、Agela Vensuil XBP C18（美国Agela公司）、Thermo hypersil C18（美国Thermo Fisher Scientific公司）；MS-105DU型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Millipore Direct-Q5纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 材料与试剂

CYG（批号JBZ-0785，质量分数≥98%）、FMG（批号JBZ-0778，质量分数≥98%）、CY（批号JBZ-0786，质量分数98.12%）、FM（批号JBZ-0156，质量分数99.40%）、AGI（批号JBZ-0501，质量分数≥98%）均购于南京金益柏生物科技有限公司。CYA、FMA、ATI对照品均由实验室自制[16]，经HPLC分析，质量分数≥98%；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），甲酸（色谱纯，Merck公司）；超纯水（Millipore超纯水系统制备）。18批炙黄芪购自8个厂家，信息见表1。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

HPLC-PDA-ELSD串联检测，色谱柱：Hedera ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm,5μm）；流动相为乙腈（A)-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0～25 min,16%～35%A;25～50 min,35%～60%A;50～60 min,60%A；检测波长260 nm；体积流量1.0 m L/min；柱温30℃；进样量10μL;ELSD参数：增益4，漂移管温度120℃，氮气体积流量2.8 L/min；在当前色谱条件下，各色谱峰分离度（R)>1.5，拖尾因子T≈1.00，见图1。

表1 炙黄芪来源信息

图1 炙黄芪混合对照品(A)和样品(B)的色谱图

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取CYG、CYA、FMG、CY、FMA、FM、AGI、ATI对照品适量，置10 m L量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度分别为242、372、43.8、52、145.6、9.82、190、236.5μg/m L的混合溶液，即得1号混合对照品溶液。将1号混合对照品溶液依次稀释2、4、8、16、32、64倍，制备得2～7号混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

采用《中国药典》2020年版炙黄芪CYG含量测定供试品处理方法[1]，即取本品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 m L，称定质量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 m L，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性

取空白溶液甲醇注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱方法进样测定。空白溶液对当前色谱方法无干扰，表明方法专属性良好。

2.4.2 线性范围、检测限与定量限

将“2.2”项下制得的混合对照品溶液，依法分别测定6种异黄酮和2种三萜皂苷的峰面积，其中6种异黄酮以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y),2种三萜皂苷以质量浓度的对数值为横坐标（ln X），峰面积的对数值为纵坐标（ln Y），进行线性回归处理，得到8种成分的回归方程、相关系数（r）及线性范围。进一步以对照品溶液逐级稀释、测定，确定各成分的检测限（LOD）及定量限（LOQ），结果显示，该8种成分在相应浓度范围内，线性关系良好，并具有较高的灵敏度，见表2。

2.4.3 精密度试验

取同一混合对照品溶液1号，连续进样6次，依法测得峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）。结果CYG、CYA、FMG、CY、FMA、FM、AGI及ATI峰面积RSD分别为0.82%、0.95%、0.86%、1.00%、1.00%、1.23%、1.71%及2.13%。表明仪器的精密度良好。

2.4.4稳定性试验

取同一炙黄芪（HX-1）样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法在0、2、4、6、8、10、12 h测得峰面积，计算RSD。结果CYG、CYA、FMG、CY、FMA、FM、AGI及ATI峰面积RSD分别为1.23%、1.11%、1.28%、1.09%、1.11%、1.07%、2.53%及2.29%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

表2 8种成分的回归方程、线性范围和检测限、定量限

Table 2 Regression equations,linear ranges,LOD and LOQ of eight components

2.4.5 重复性试验

取同一批次炙黄芪（HX-1）样品，平行6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，并计算各成分的平均质量分数及RSD，结果测得该批次炙黄芪样品的CYG、CYA、FMG、CY、FMA、FM、AGI及ATI含量分别为0.363、0.733、0.078、0.114、0.218、0.024、0.623、0.561 mg/g,RSD分别为2.97%、2.61%、2.82%、2.47%、2.42%、2.15%、2.31%及3.02%。表明方法的重复性良好。

2.4.6加样回收率试验

取已测定的炙黄芪（HX-1）粉末（过四号筛）0.5 g，精密称定，平行6份，分别按饮片含量-对照品（1∶1）加入一定量的对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算加样回收率，CYG、CYA、FMG、CY、FMA、FM、AGI及ATI的加样回收率分别为102.2%、101.5%、99.9%、101.1%、100.3%、97.0%、98.4%及97.4%,RSD分别为2.07%、1.65%、1.50%、1.45%、1.34%、1.94%、2.46%及1.79%。

2.5 相对校正因子的确定

2.5.1 相对校正因子的计算

按“2.2”项下方法制备1～6号混合对照品溶液，依法测定8种成分的峰面积。6种异黄酮，以CYG为内参物，采用多点法[18]计算CYG相对于CYA、FMG、CY、FMA、FM的校正因子（relative correction factors,RCFs，记为fk/s）。

Cs为内参物浓度，As为内参物峰面积；Ck为待测组分浓度，Ak为待测组分峰面积

2种三萜皂苷以AGI为内参物，采用多点法[18]计算AGI相对于ATI的校正因子fATI/AGI。

结果显示（表3），采用多点法计算获得的相对校正因子f CYA/CYG、f FMG/CYG、f CY/CYG、f FMA/CYG、fFM/CYG、fATI/AGI分别为0.984、1.772、1.427、1.318、2.546、0.976,RSD≤3.19%。

2.5.2 不同仪器及色谱柱测得的相对校正因子比较采用Waters e2695-PDA-ELSD1(ELSD1

型号：Altech/2000ES）、Waters e2695-PDA-ELSD2(ELSD2型号：Allchrom model 6000)2种仪器，以Hedera ODS-2 C18、Agela Vensuil XBP C18、Thermo hypersil C183种不同品牌的色谱柱，分别测定并计算CYG与异黄酮类成分及AGI与三萜皂苷类成分的相对校正因子，计算RSD。结果显示，内参物与各成分在不同仪器上的fk/s的RSD<3.0%，表明炙黄芪中8个成分在不同仪器及色谱柱上的耐用性较好，见表4。

表3 多点法测定的待测成分fk/s

表4 不同仪器、色谱柱条件下待测成分的fk/s

2.5.3 不同柱温、体积流量对fk/s的影响

采用Waters e2695-PDA-ELSD1仪器和Hedera ODS-2C18色谱柱，分别测定并计算不同柱温条件下（25、30、35℃）及不同体积流量（0.9、1.0、1.1m L/min)CYG与异黄酮类成分及AGI与三萜皂苷类成分的fk/s，计算RSD。结果显示，内参物与各成分的fk/s的RSD<3.0%，表明fk/s在温度25～35℃及体积流量0.9～1.1 m L/min的耐受性良好，见表5。

2.5.4 待测成分色谱峰的定位

待测成分色谱峰的准确定位是实现一测多评的前提，本研究采用“相对保留值法”（各成分与内参物的保留时间比值tk/s）对炙黄芪8个待测组分的保留时间进行了考察。结果显示待测成分与内参物相对保留值的差异较小CYA、FMG、CY、FMA、FM相对于CYA的相对保留值均值分别为1.759、1.840、2.313、2.677、3.414,ATI相对于AGI的相对保留值均值为1.250,RSD≤2.64%，表明采用待测组分与内参物相对保留值来定位具有可行性，见表6。

表5 不同柱温、体积流量下的待测成分fk/s

表6 不同仪器、色谱柱条件下测得的相对保留时间比值

2.5.5 样品含量测定及QAMS法的验证

按“2.3”项下方法，分别制备采集的8个厂家共18批炙黄芪，依法测定，进一步采用外标法（external standard method,ESM）和QAMS法对所测得的数据分别进行含量计算，并以相对误差（relative error,RE）进行评价，以验证QAMS法测定上述8种成分含量的准确性，结果见表7、8。结果显示，在18批炙黄芪中均能测得该8种成分，ESM与QAMS测得的6种异黄酮含量结果差异较小，RE<5.0%，表明QAMS法检测的含量结果准确，能够满足炙黄芪中6种异黄酮的含量测定要求。而2种三萜皂苷ESM与QAMS法测得结果差异较大，表明针对该组分建立的QAMS法稳定性不好，应选用ESM进行含量测定。

表7 ESM与QAMS测定炙黄芪中6种异黄酮的含量（n=2)

表8 ESM与QAMS测定炙黄芪中2种三萜皂苷的含量（n=2)

3、讨论

3.1 分析方法的建立与优化

采用二极管阵列检测器，对6种异黄酮类成分进行了200～400 nm扫描，结果显示，该6种成分的紫外光谱图中，CYG、CYA、CY、FM均在247～291 nm波长处有最大吸收，FMG、FMA分别在251、258 nm处有最大吸收。研究发现，在260 nm波长条件下6种待测成分的灵敏度均较好，且色谱图基线平稳，具有良好的分离度，满足定量分析的要求。因此，最终选择260 nm作为检测波长。

本研究采用我国现行药典检测炙黄芪CYG的甲醇回流提取样品制备方法，未采用检测黄芪甲苷加4%浓氨的80%甲醇回流提取方法[1]。主要考虑检测三萜皂苷时的目标不一致，本方法可表征黄芪蜜炙后转化的成分乙酰黄芪皂苷I及未转化的成分黄芪皂苷I。而药典法通过碱水解法检测黄芪甲苷含量来表征炙黄芪中总皂苷含量，此反应受碱性条件、提取时间等影响，难以转化完全[19]，不能较为全面真实地反映炙黄芪中乙酰基成分的含量，而该类成分为炙黄芪特征成分，含量相对较高，选用甲醇回流提取方法能检测到该类成分，且8种成分在当前样品制备方法中稳定，故选用此方法。

本研究相较于药典中炙黄芪的含测指标，增加了5个异黄酮类成分：CYA、CY、FMA、FMG、FM以及2个三萜皂苷类成分：AGI、ATI，保留药典中CYG、并去除黄芪甲苷含测指标，其中CYG、CY、FMG、FM、AGI为主要指标成分，药理作用明确，相关研究颇多，既是效用成分又是主要指标成分。CYA、FMA、ATI为炙黄芪特征性成分，含量较高，既是特征成分亦是主要指标成分，已有初步研究表明这些乙酰基成分具有良好的生物活性[20-24]。此外，从成分变化来判断炮制程度的深浅，从而用于提升炙黄芪饮片的质量，这些指标是呈关联性、动态性变化，例如炮制程度很浅，可检测到丙二酰毛蕊异黄酮苷、丙二酰芒柄花苷、丙二酰黄芪皂苷I，与黄芪几乎无差异，相应的CYA、CYG、FMA、FMG、ATI的含量会很低；炮制程度完全，丙二酰基成分几乎检测不到，相应的CYA、CYG、FMA、FMG、ATI的含量会升高，增加以上指标有利于区分黄芪及炙黄芪，从而更全面地对炙黄芪质量进行控制。

本研究在色谱条件优化过程中发现，不同型号C18色谱柱对异黄酮类成分的分离效果影响显著，在考察已有的6种型号色谱柱中，仅Hedera ODS-2C18、Agela Vensil XBP C18、Thermo hypersil C18,3种色谱柱可以实现对8种组分的有效分离（R>1.5），其余色谱柱的分离效果不佳，不能将CYA与FMG色谱峰分开，影响分析结果。

3.2 内参物的选择

由于对照品价格相对昂贵或不易获得，所以内参物应尽量选择在样品中含量较高、易获得且保留时间适中的有效成分。本研究中，6种异黄酮，选择CYG为内参物，主要考虑该物质在我国现行药典炙黄芪标准中已有使用，性质稳定且易于获得。2种三萜皂苷，以AGI为内参物，主要考虑该物质为炙黄芪原有的皂苷，含量较高且较易获得。故选用以上成分作为QAMS法的内参物。各成分相对校正因子fk/s的RSD均小于3%，不同仪器、色谱柱、柱温、体积流量对fk/s的影响较小（RSD<3%），表明建立QAMS法选择该2种成分作为内参物具有可行性。

3.3 炙黄芪中8种特征成分QAMS的结果分析

本研究中，对于HPLC-PDA检测的6种异黄酮，QAMS法与ESM的所得结果相对误差均在5%以内，验证了QAMS法所得结果准确。在多指标测定以及对照品短缺的情况下，该法能够替代ESM实现多成分的定量分析。

对于HPLC-ELSD检测的2种三萜皂苷，QAMS法与ESM所得结果相对误差较大，其根本原因在于检测器检测原理的不同，相较于PDA,ELSD的响应强度和噪音水平主要受洗脱液雾化后形成的气溶胶颗粒大小、粒径分布以及流动相蒸发的程度的影响，响应值与样品物质的量呈指数关系[25]，从而导致误差在经指数换算后的数值上放大。当对照品和样品的浓度在一定范围内，ELSD非线性曲线有一段可以近似为线性的响应区域，以该区域的参数来建立QAMS法理论上是可行的。本研究中，所使用的ELSD为雾化器不分流、直型漂移管类型，有较好峰形的同时，并受温度及载气体积流量较大的影响[26]。因此，在ELSD上建立的QAMS法需要视上述待测组分性质、仪器条件等，深入研究方法的适用范围与准确性。

目前炙黄芪主要靠现行药典参照蜜炙法“炒至不粘手”等性状及2个定量指标来进行质量控制，尚不能全面反映炙黄芪的内在质量。基于蜜炙前后黄芪化学成分的转化机制，在测定的8个厂家共18批炙黄芪中，不同厂家的乙酰基成分含量差异较大，侧面反映了黄芪的蜜炙程度不一，相关成分转化程度不一，缺乏明确且统一的工艺参数，这样很可能会影响到炙黄芪质量及临床疗效。炙黄芪中除了药典规定的2种含量测定指标，含有主要指标成分，包括特征乙酰基成分（CYA、FMA、ATI）、异黄酮（CYA、CYG、FMA、FMG、CY、FM）、三萜皂苷（AGI、ATI），建议将以上成分作为质控指标。

本研究建立了炙黄芪8种成分的分析方法，同时建立了6种异黄酮的QAMS质控方法，为炙黄芪的质量控制提供依据。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81973482);

文章来源:黄沈辉,李洋,孙捷,等.基于HPLC-PDA-ELSD的炙黄芪特征成分一测多评适用性研究[J].中草药,2024,55(15):5230-5237.