HIV-1感染常会导致患者发生非特异性、广泛的异常免疫活化[1,2]，而血小板活化增加是HIV感染者机体持续性免疫活化的重要组成部分[3,4]。除参与止血功能，越来越多证据表明血小板还是一种免疫细胞，能够发挥重要的免疫调节作用[5]。活化的血小板释放多种活性物质进一步激活机体免疫细胞[6,7]，过度免疫活化导致患者免疫应答能力低下，由此引发多种机会性感染及非艾滋病定义性事件[1,8]。除释放可溶性介质外，血小板活化上调表达CD62P、CD40L、GPⅡb/Ⅲa等表面分子，并促进其与表达相应配体的免疫细胞形成聚合体[9]，进一步发挥募集免疫细胞、诱导免疫细胞表型转换及调控免疫细胞功能等作用[10,11,12]。

在感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病等多种类型疾病中均观察到血小板-免疫细胞聚合体增多的现象[13,14,15,16]，但研究主要集中在血小板对单核细胞、中性粒细胞等固有免疫细胞的调控[17,18]，对适应性免疫应答的研究较少。因此探究活化型血小板-CD4细胞聚合体与HIV/AIDS患者疾病进展的相关性，对于进一步改善临床治疗方案具有重要意义。

本研究通过检测不同人群中活化型血小板-CD4细胞聚合体的比例变化以及该比例与HIV感染疾病相关的主要临床指标和血小板、CD4细胞自身活化程度的相关性，探讨活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与HIV/AIDS患者疾病进展及免疫恢复的关系以及影响活化型血小板-CD4细胞聚合体形成的原因。

1、对象与方法

1.1 对象

纳入2022年7月至2023年6月就诊于首都医科大学附属北京地坛医院的HIV/AIDS患者131例，其中包括未经c ART的HIV-1感染者（Treatment naïve,TN)100例；c ART时间大于4年，VL始终低于检测下限，CD4细胞计数小于350个/µL的免疫无应答者（Immunological Non-responders,INR)13例；ART时间大于4年，VL始终低于检测下限，CD4细胞计数大于500个/µL的免疫应答者（Immunological Responders,IR)18例。另入组HIV检测阴性的健康对照（Healthy Controls,HC)20例。参照中国艾滋病诊断指南（2021版）标准进行患者入组，排除当前患有HBV、HCV等合并感染、机会性感染、其他自身免疫性等疾病的患者。本研究经首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会批准（编号：NO.DTEC-KY2021-022-03），且所有入组对象均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mono‐nuclear Cells,PBMC）分离

使用枸橼酸钠采血管抽取3 m L静脉血。采集2 h内，以150 g离心15 min，吸取上层富血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）后，使用淋巴细胞分离液（购于加拿大Stemcell公司）根据密度梯度离心法分离PBMC。

1.2.2 血小板活化水平检测

向PRP中加入100n M前列腺素E1 (PGE1，购于美国Sigma-Aldrich公司），充分混匀后，经700 g离心10 min获取血小板沉淀，使用CGS缓冲液（13 m M trisodium citrate,33 m MD-glucose,123 m M Na Cl,p H 6.5）重悬血小板沉淀，洗涤两次获取纯化血小板，最后采用Tyrode's缓冲液（2.5 m M HEPES,150 m M Na Cl,2.5 m M KCl,12 m M Na HCO3,1 m M Ca Cl2,1 m M Mg Cl2,5.5 m MD-glucose,p H 7.4）进行重悬。取100µL血小板悬液，加入anti-human CD41a-BV510、CD62P-APC抗体（购于美国BD公司），室温避光孵育30 min后，等体积加入4%多聚甲醛固定，利用BD LSRFortessa流式细胞仪检测血小板活化程度。

1.2.3 CD4细胞免疫表型及凋亡水平检测

取1×106个PBMC进行CD3-BUV737、CD4-APC-Fir750、CD8-BUV395、CD41a-BV510、CD62P-APC、CD45RA-AF700、CCR7-BV421、TIGIT-PE-CY7、PD-1-BV711、TIM-3-BV650、CD95-PE-CF594抗体（购于美国BD公司）染色，室温避光孵育30 min后加入1 m L cell stain buffer充分混匀，离心弃上清，之后加入100µL binding buffer，弹匀后加入2µL Annexin V荧光抗体（购于美国Biolegend公司），室温避光孵育15 min。最后加入500µL binding buffer,PBS洗涤后重悬，上机前5 min加入3µL 7-AAD，利用BD LSRFortessa流式细胞仪进行检测。CD3+CD4+CD8-CD41a+、CD3+CD4+CD8-CD41a+CD62P-、CD3+CD4+CD8-CD41a+CD62P+分别为总血小板-CD4细胞聚合体、未活化型血小板-CD4细胞聚合体与活化型血小板-CD4细胞聚合体的鉴定依据。

1.2.4 CD4、CD8细胞计数

将50µL全血反相加入Tru Count管，加入20µL T淋巴细胞亚群检测抗体，充分混匀，室温避光孵育20 min，加入450µL溶血素，室温孵育15 min后，使用FACS Calibur型流式细胞分析仪检测并记录数据。上机前用标准荧光微球，采用FACSComp软件对机器进行质量检测和调试以保证各项质控数值在正常范围内。上机检测时，采用MµLtiset软件获取数据，并分析T淋巴细胞亚群百分比及细胞绝对计数。

1.2.5 病毒载量检测

采用Roche公司人类免疫缺陷病毒HIV-1定量检测仪（Roche Diagnostics,Indianapolis,in,USA）对血浆中的HIV-1 RNA水平进行定量检测。

1.3 统计分析

应用Graph Pad Prism 9.0进行统计分析和作图，Flow Jo-V10进行流式数据分析。非正态分布资料使用M(P25,P75）描述，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两组间非配对比较使用MannWhitney秩和检验，配对检验使用Wilcoxon符号秩和检验，二分类变量采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关检验。P<0.05表明差异有统计学意义。

2、结果

2.1 入组对象的基本特征

本研究共入组对象151例，其中TN组100例，INR组13例，IR组18例，HC组20例。入组对象基本信息见表1。使用多组间比较入组对象的基本信息，组间年龄、性别差异均无统计学差异，CD4细胞计数、CD8细胞计数、CD4/CD8细胞比值等HIV/AIDS患者疾病进展有关的指标差异有统计学意义，符合入组对象的特点。

表1 研究对象的基本信息[M(P25,P75)]  

2.2 健康对照及不同疾病阶段的HIV/AIDS患者外周血活化型血小板-CD4细胞聚合体比例情况

活化型血小板-CD4细胞聚合体的流式圈门策略如图1A所示。结果显示TN组活化型血小板-CD4细胞聚合体比例较HC组（中位数6.420 vs.5.200,Z=2.093,P=0.033 2）显著增高。经c ART后，IR组活化型血小板-CD4细胞聚合体比例相比TN组降低（中位数4.535 vs.6.420,Z=2.776,P=0.005 3），恢复至与HC组接近的水平（中位数4.535 vs.5.200,Z=0.609 8,P=0.496 5）。而INR组活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与TN组（中位数6.730 vs.6.420,Z=0.654 2,P=0.511 2）差异无统计学意义，仍高于HC组（中位数6.730 vs.5.200,Z=1.981,P=0.016 1）（图1B,C）。

对TN组CD4细胞计数进行分层分析，结果显示主要为CD4细胞计数小于200个/µL的TN患者活化型血小板-CD4细胞聚合体比例增加，较HC组（中位数12.65 vs.5.200,Z=4.375,P<0.000 1）、CD4细胞计数在200到350个/µL之间（中位数12.65 vs.6.010,Z=2.861,P=0.000 5）及CD4细胞计数大于350个/µL（中位数12.65 vs.5.370,Z=4.954,P<0.000 1）的TN组显著增高；CD4细胞计数在200到350个/µL之间的TN组较HC组相比略微增加（中位数6.010 vs.5.200,Z=1.747,P=0.034 7）；而CD4细胞计数大于350个/µL的TN患者与HC组（中位数5.370 vs.5.200,Z=0.339 1,P=0.506 8）及CD4细胞计数在200到350个/µL之间的TN组（中位数5.370 vs.6.010,P=0.057 9）均未见统计学差异（图1D）。

图1 不同疾病阶段HIV/AIDS患者外周血活化型血小板-CD4细胞聚合体比例的比较  

2.3 总血小板/活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与疾病进展的关系

TN组患者总血小板/活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞计数、CD4/CD8细胞比值均具有显著负相关趋势，但活化型血小板-CD4聚合体比例与CD4细胞计数（r=-0.553 0,P<0.000 1）、CD4/CD8细胞比值（r=-0.601 5,P<0.000 1）的相关性优于总血小板-CD4+T聚合体比例与CD4细胞计数（r=-0.362 6,P=0.000 2）、CD4/CD8细胞比值的相关性（r=-0.324 2,P=0.001 0）。此外，活化型血小板-CD4聚合体比例与病毒载量呈正相关趋势（r=0.329 8,P=0.001 0），而总血小板-CD4聚合体比例与病毒载量未见存在相关性（r=-0.007 949,P=0.938 4）（表2）。

2.4 影响活化型血小板-CD4细胞聚合体形成的因素分析

TN组患者活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞自身活化程度具有显著正相关趋势（r=0.426 2,P=0.005 5）（图2A）。亚群分析显示，结合活化血小板的CD4细胞较结合未活化血小板（中位数44.27 vs.37.82,Z=5.174,P<0.000 1）及未结合血小板的CD4细胞（中位数44.27 vs.32.77,Z=8.513,P<0.000 1）活化水平更高，并且结合未活化血小板的CD4细胞较未结合血小板的CD4细胞具有更高的活化水平（中位数37.82 vs.32.77,Z=3.340,P=0.001 6）（图2B）。此外，活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与外周血中血小板计数（r=0.008 997,P=0.929 9）无相关性；与血小板活化程度有正相关趋势，但并无统计学意义（r=-0.031 62,P=0.886 1）（图2C、D）。

表2 总血小板/活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与临床指标的相关性分析  

图2 影响活化型血小板-CD4细胞聚合体形成的因素分析   

2.5 不同记忆分化程度的CD4细胞结合活化型血小板的比例比较

对CD4细胞的四个不同记忆分化程度亚群：初始细胞（naïve,CD45RA+CCR7+）、中央记忆细胞（Central memory T Cell,TCM,CD45RA-CCR7+）、效应记忆细胞（Effector memory T Cell,TEM,CD45RA-CCR7-）及终末分化效应记忆细胞（terminally differentiated effector memory T cells,TEMRA,CD45RA+CCR7-）与活化型血小板结合的比例进行比较（图3A）。结果表明在TN组中，活化型血小板与记忆型CD4细胞的结合比例显著高于naïve亚群（TCM vs naïve：中位数5.320 vs.2.630,z=3.529,P<0.000 1;TEM vs.naïve：中位数11.10 vs.2.630,Z=9.379,P<0.000 1;TEMRA vs.naïve：中位数10.70 vs.2.630,Z=8.905,P<0.000 1），并且TEM与TEMRA亚群均高于TCM亚群（TEM vs.TCM：中位数11.10 vs.5.320,Z=5.851,P<0.000 1;TEMRA vs.TCM：中位数10.70 vs.5.320,Z=5.376,P<0.000 1），而TEM与TEM-RA亚群结合活化血小板的比例接近（TEM vs.TEM-RA：中位数11.10 vs.10.70,Z=0.474 2,P=0.750 2）（图3B）。

图3 不同记忆分化状态的CD4细胞结合活化血小板的比例比较  

在TN组患者的CD45RA-memory CD4细胞中，总/活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞计数、CD4/CD8细胞比值均具有显著负相关趋势，但活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞计数（r=-0.536 2,P<0.000 1）、CD4/CD8细胞比值（r=-0.598 6,P<0.000 1）的相关性优于非活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞计数（r=-0.332 5,P=0.000 7）、CD4/CD8细胞比值的相关性（r=-0.303 5,P=0.002 1）。此外结果表明CD45RA-memory CD4细胞中活化型血小板-CD4细胞聚合体比例（r=0.316 3,P=0.001 0）而非总血小板-CD4细胞聚合体比例与病毒载量（r=-0.001 566,P=0.870 0）呈正相关（表3）。  

表3 记忆亚群中总/活化型血小板-CD4细胞聚合体与临床指标的相关性分析  

2.6 未结合、结合未活化及结合活化血小板的CD4细胞表型特征

TN组患者结合活化血小板的CD4细胞较未结合及结合未活化血小板的CD4细胞表达更高水平的共抑制分子PD-1（图4A）、TIGIT（图4B）、TIM-3（图4C）及凋亡相关分子Annexin V（图4D）、CD95（图4E)(PD-1:c vs.a中位数24.96 vs.12.12,Z=8.609,P<0.000 1,c vs.b中位数24.96 vs.14.40,Z=4.808,P<0.000 1;TIGIT:c vs.a中位数35.70vs.26.84,Z=7.942,P<0.000 1,c vs.b中位数35.70 vs.24.87,Z=4.371,P<0.000 1;TIM-3:c vs.a中位数5.580 vs.0.795 0,Z=9.487,P<0.000 1,c vs.b中位数5.580 vs.23.05,Z=4.587,P<0.000 1;Annexin V:c vs.a中位数57.41 vs.9.460,Z=7.211,P<0.000 1,c vs.b中位数57.41 vs.29.05,Z=3.606,P<0.000 1;CD95:c vs.a中位数84.30 vs.59.18,Z=6.872,P<0.000 1,c vs.b中位数84.30 vs.70.80,Z=3.538,P<0.000 1）。

图4 CD41a-CD62P-CD4+T细胞、CD41a+CD62P-CD4+T细胞、CD41a+CD62P+CD4+T细胞的表型特征   

3、讨论

血小板活化水平增加是HIV/AIDS患者的一个重要特征[3,19,20,21,22,23]。多种因素参与了HIV感染者血小板活化的调节，如血小板内化吞噬HIV-1[24,25]、HIV-1结构蛋白促进血小板NAPDH氧化酶激活[26]、微生物移位[27]以及c ART本身[15,28,29,30]等。既往多关注血小板在止血中发挥的作用，近来研究发现血小板还能够调控免疫应答。除直接分泌转化生长因子β、血小板因子4等可溶性介质[6,31]外，形成血小板-免疫细胞聚合体是血小板发挥免疫调控作用的主要形式，能够发挥募集免疫细胞[11]、促进炎症介质合成[32]、诱导免疫细胞表型转化[12]及调节免疫细胞功能[33]等作用。

在多种感染性疾病[14,20,21]中已经观察到血小板-单核细胞/中性粒细胞/T淋巴细胞聚合体比例的增加的现象，聚合体比例的增加促进了血液的高凝状态，增加患者心血管疾病的发生风险[34,35]。血小板与单核细胞形成聚合体促进单核细胞向CD16+表型转变，增强其促炎作用，并介导单核细胞跨越血脑屏障，增加HIV/AIDS患者中枢神经系统炎症的发生[36,37]；血小板与中性粒细胞形成聚合体能够介导中性粒细胞胞外诱捕网的形成，促进COVID-19患者免疫血栓的形成[38]；血小板与CD4细胞形成聚合体驱动与之结合的CD4细胞感染HIV，从而促进HIV在体内的传播[22,39]；脓毒血症期间血小板通过MHC-I处理呈递抗原，与抗原特异性CD8细胞结合，导致CD8细胞数量减少，胞内IFN-γ生成受损[33]。目前关于血小板-T淋巴细胞聚合体与HIV/AIDS患者免疫状态的关系仍不明确，本研究对此进行了讨论。

本研究发现TN患者活化型血小板-CD4细胞聚合体比例较HC上调，这可能促进了HIV-1感染期间的高凝血状态。在经c ART后，IR患者比例下降而INR患者未见比例减低，表明活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与c ART后免疫重建情况相关。此外，本研究发现活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞计数、CD4/CD8细胞比值呈显著正相关，较既往文献报道的总血小板-CD4细胞聚合体比例[21]相关性更强，表明活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与疾病进展更加相关，提示可能是活化血小板而非未活化血小板对CD4细胞发挥了免疫调控作用。

本研究进一步发现与活化型血小板结合的CD4细胞较与未活化血小板结合及未结合血小板的CD4细胞呈现表达更高水平共抑制分子及凋亡分子的表型特征。既往在类风湿性关节炎[40]及HIV-1感染[21]的研究中均观察到与血小板结合的CD4细胞和未与血小板结合的CD4细胞存在表型差异，形成聚合体的CD4细胞呈现更加活化及凋亡的表型特征，但并未对活化型血小板-CD4细胞这一亚群进行分析。本研究结果提示：活化血小板可能主要参与对CD4细胞耗竭与凋亡进程的免疫调控，具体机制有待进一步研究。

既往文献发现血小板及免疫细胞的活化增加均可促进血小板与免疫细胞形成聚合体，CD62P-PSGL-1、CD40L-CD40和GPⅡb/Ⅲa-v WF等分子对介导了聚合体的形成[41,42]。本研究观察到：活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与CD4细胞自身活化程度呈显著正相关，并且活化血小板更容易与分化程度高的CD4细胞亚群发生结合形成聚合体；然而活化型血小板-CD4细胞聚合体比例与外周血中血小板自身活化程度及血小板计数未见相关性。提示：活化血小板-CD4细胞聚合体的形成主要受体内CD4细胞的活化水平的影响。鉴于活化型血小板-CD4细胞聚合体可能促进HIV-1感染期间高凝血状态的发生，以及其对CD4细胞的功能存在潜在损伤作用，抑制CD4细胞过度活化并减少该聚合体的形成可能成为改善HIV/AIDS患者预后的免疫治疗手段。

本研究存在一定的局限性，入组的IR及INR患者数量有限，无法准确表明活化血小板-CD4细胞聚合体与c ART效果的相关性。其次，本研究为横断面研究，未能描述在治疗过程中活化血小板-CD4细胞聚合体的动态变化。

综上，本研究发现活化血小板-CD4细胞聚合体在未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者中显著上调，并且该比例与CD4细胞计数、CD4/CD8细胞比值具有显著负相关，与病毒载量具有正相关趋势，提示活化型血小板-CD4细胞聚合体的形成与HIV/AIDS患者的疾病进展关系密切，对疾病分期和临床管理具有指导意义。

参考文献:

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基金资助:北京市杰出青年科学基金项目(JQ21023);北京市高层次公共卫生技术人才建设项目(学科骨干-02-27);北京市医管中心项目(DFL20191802);北京市医院管理局临床医学发展专项(ZYLX202126)~~;

文章来源:蒋梅青,王芯栎,赵萌等.活化型血小板-CD4细胞聚合体与HIV/AIDS患者免疫状态的关系[J].中国艾滋病性病,2024,30(02):131-139.