随着社会经济的快速发展和生活水平的日益提高，人们越来越注重皮肤护理，在保证安全性的基础上，化妆品的功效性成为消费者关心的重点。化妆品功效评价是对其功效性宣称进行科学支持的有效手段，通过生物化学、细胞生物学、临床评价等多种方法对化妆品功效进行综合测试、合理分析和科学解释。皮肤生理学检测是化妆品功效评价的方法之一，通过在体的无创胶带粘贴技术取样，再多维度分析表征皮肤生理状态的各项指标。此外，皮肤生理学检测不局限于化妆品功效评价，其还可以通过检测皮肤各项指标，发现人群的肌肤问题，为精准护肤提供科学支持。

1、皮肤生理学检测的概念

1.1皮肤生理结构与功能

皮肤是一种由表皮和真皮组成的多层高度非线性、各向异性、黏弹性材料[1]。皮肤与外界环境直接接触，其结构复杂且细胞功能高度特异化。皮肤中含有各种类型的细胞，如成纤维母细胞、角朊细胞、黑素细胞等，它们各自执行相应的功能，使皮肤作为一个相对独立的组织系统，与其他器官组织一起参与机体的代谢活动。其次，皮肤作为人体表面最大的器官，具有阻挡外界有害物质入侵和阻止体表水分、脂类等营养物质流失的作用，是人体的首道生理屏障。一般人们多采用“砖块-灰浆”结构来形容皮肤屏障结构，即由角质层细胞及其内部的结构蛋白（丝聚蛋白、兜甲蛋白等）构成“砖块”结构，细胞间脂质构成“泥浆”部分，共同维持皮肤屏障的结构和功能[2]。近年来研究[3]表明，皮肤为菌丛提供了适宜的生存场所，同时这些菌丛间的相互作用也为宿主提供了直接或间接的保护。广义的皮肤屏障功能指其物理性屏障作用、色素屏障作用、神经屏障作用、免疫屏障作用以及其他与皮肤功能相关的诸多方面；狭义的皮肤屏障功能通常指表皮，尤其是角质层的物理性或机械性屏障结构。从细胞分化和组织形成的角度来看，皮肤的物理性屏障功能不仅依赖于表皮角质层，而且依赖于表皮全层结构；从生化组成和功能作用方面来看，表皮的物理性屏障结构不仅和表皮的脂质有关，也和表皮的各种蛋白质、水、无机盐以及其他代谢产物密切相关。这些成分的任何异常都会影响皮肤的屏障功能，不同程度地参与或触发临床皮肤疾病的病因及病理过程[4]。

1.2皮肤生理学检测

皮肤生理学检测（cutaneous biological test,CBT）是一种皮肤精细生理指标检测体系，即采用皮肤胶带粘贴（tape stripping）的方法采样，通过显微镜观察、成分分析、免疫学检测、多组学技术，从皮肤表观生理学到组织、细胞再到蛋白、基因水平对胶带上采集的皮肤样本进行多角度、多层面的原位测定，依据相应皮肤生理学指标的变化，深入挖掘肌肤问题的成因和机制，为科学研究皮肤以及化妆品的功效评价提供个体化、精准和全面的人体皮肤大数据支持。

2、皮肤生理学检测的方法及指标

皮肤生理学检测按照测定的方法和指标，可分为形态组、脂质组、微生物组和功能组。

2.1形态组

角质层在表皮的最外层，由多层扁平的角质细胞组成。这些细胞是已经完全角化的细胞，核和细胞器都已消失。在HE染色切片上呈均质伊红色，细胞轮廓不清，最表层的细胞连接松散且趋向脱落，即为鳞屑。角化包膜（cornified envelope,CE）是角质层细胞的包膜，可为胞间脂质提供正确的结合点。如果CE不成熟，即使细胞间脂质的数量充足，也不能形成整齐的角质层砖墙状结构[5]。角质层粘贴技术是用涂有黏性材料的胶带、圆盘或者玻片粘贴皮肤，作用于表皮角质层的黏附力可使鳞屑脱落，从而观察角质层的生理和病理学变化[6]。

目前采用角质层粘贴技术进行皮肤采样的方法有两种，第一种是利用D-Squame®（Cuderm,TX,United States）黏贴盘进行采样，D-Squame® 黏贴盘是由透明聚酯薄膜构成的小圆盘，上面覆盖压力敏感黏合剂。胶带粘取角质层数量的多少受多种因素的影响，例如胶带粘贴的方式、次数、粘贴施加的压力、时间、皮肤的含水量、皮肤角质层细胞之间的内聚力、不同的身体部位和个体差异等[7]。第二种是利用Corneofix® （Courage+Khazaka GmbH,Cologne,Germany）胶带进行采样，Corneofix®是一种透明聚酯薄膜胶带，胶带的一侧有延伸出来的手柄，方便操作者持捏，而不污染粘贴鳞屑的待测部位；胶带可以根据测试部位的面积剪取不同的大小。该方法容易受到外界物质，如头发、灰尘等影响，因此采集到的贴片应立即分析或者完整保存再分析[8]。

皮肤鳞屑的产生是人体皮肤干燥的一个表现，可以利用角质黏贴胶带采取鳞屑样本的方法来评价保湿产品的功效性[9]。Gorcea等[10]通过使用胶带剥离方法研究脸颊和前臂掌侧皮肤的角质细胞大小，结果表明，随着胶带剥离深度的增加，面部脸颊与前臂掌侧部位的角质细胞大小均显著减少，且面部皮肤的角质细胞明显小于前臂掌侧皮肤的角质细胞。Black等[11]研究使用保湿产品前后皮肤的鳞屑参数变化，利用角质层粘贴技术进行皮肤鳞屑采样，结果发现使用保湿产品两周后皮肤鳞屑值明显减少。Chen等[12]研究城市污染对皮肤状态的影响，使用D-Squame®技术检测皮肤鳞屑值来评估皮肤干燥度，结果显示，市区组志愿者的皮肤干燥度明显高于郊区组。

成熟的CE因其具有脂质包膜而疏水性较强，易被亲脂性的尼罗红染色，不成熟的CE因脂质合成减少且包膜不完整，疏水性较弱，更易与抗内皮蛋白的抗体结合而被其偶联的荧光染料染色。因此，根据CE的染色情况来判断其成熟度，可用于评估皮肤屏障的受损情况[13]。当皮肤屏障受损时不成熟的CE增多，通过计算不成熟CE占总CE的比例即可评估CE的成熟度，继而反映皮肤屏障状况[14]。Ping等[15]开发一款含有促进CE成熟的保湿化妆品，在受试者连续使用4周后，检测到受试者角质层中未成熟CE的数量明显减少，从而验证了该保湿化妆品对CE成熟度及皮肤屏障修复有促进作用。Shuji等[16]研究发现湿疹婴幼儿在接受人催乳素诱导蛋白（human prolactin-induced protein,hPIP）治疗后，面部皮肤CE中的疏水性脂质明显减少，皮肤屏障受损加剧。

2.2脂质组

皮肤表面的脂质主要来源于皮脂腺分泌和表皮细胞的脂质。皮肤中75%～90%的脂质来源于皮脂腺分泌，表皮层是机体脂质代谢最为活跃的部位，10%～25%的脂质由表皮层合成[17]。皮肤表面脂质中皮脂腺分泌的脂质含量高达100～500μg/cm2，相比而言，表皮脂质的含量则只有25～40μg/cm2[18]。皮脂腺分泌的脂质，主要含有甘油三酯、脂肪酸、角鲨烯、蜡酯、胆固醇酯和胆固醇[19]。表皮脂质中含有皮脂腺脂质没有的神经酰胺、磷脂等，几乎不含有角鲨烯、蜡酯等成分。刚分泌出来的皮脂中不含有游离脂肪酸，它是毛囊内的寄生菌水解甘油三酯形成的，能够抑制部分细菌和真菌。表皮层中的角质细胞和填充在角质细胞间隙中的脂质紧密结合，限制水分在细胞内外及细胞间流动，阻止真皮营养物质、保湿因子、水分散失，使角质层含水量保持在20%左右，对皮肤起到滋润保湿作用。

目前提取皮肤表面脂质最常用的方法是脂带法，比较常用的胶带是Corneofix®。将胶带采集的脂质溶解于一定比例的环己烷/乙醇溶液中，脂质提取物在氮气条件下干燥，通过自动化高能色谱分析仪和气相色谱仪定量分析角质层脂质的具体成分[20]。脂带法操作简便、使用范围广，常用于皮肤科临床研究、化妆品功效评价等。Rogers等[21]研究发现皮肤角质层脂质成分的含量会随年龄升高而降低，尤其是皮脂中的神经酰胺、胆固醇、脂肪酸等成分。Gan等[22]研究发现青年女性面部皮肤表面脂质（skin surface lipids,SSL）在早晨和晚上有明显的差异，进一步分析发现，早晚面部SSL的八大类脂质成分和含量均有差异，且常见的甘油三酯、甘油二酯和神经酰胺等脂质成分也有不同，而这些差异脂质可能与不同节律下的皮肤状态有关。Paepe等[23]研究季节变化对鼻唇皮肤状况的影响，在秋冬两季利用胶粘法采集受试者鼻唇区域的皮肤表面脂质，结果显示鼻唇区域皮肤表面脂质中的甘油三酯和胆固醇酯在冬季会明显下降，这表明天气较冷时，皮肤屏障容易被破坏。皮肤脂质在皮肤屏障中担任重要的角色，通过皮肤生理学检测方法检测皮肤脂质的含量和构成可以用于评价化妆品对皮肤屏障的修复能力，为相关功效宣称提供科学支持。Tamura等[24]通过胶贴采样的方法采集人唇部的神经酰胺，发现唇部经皮失水量（TEWL）与神经酰胺含量相关，因此可通过使用含神经酰胺的唇部护理产品改善唇部皮肤的状况。Boiten等[25]研究连续16 d使用一种含有神经酰胺的制剂对受试者皮肤脂质及皮肤屏障修复的作用，结果发现使用该制剂后受损皮肤中的皮肤脂质（神经酰胺）含量显著增加，且该制剂促进了皮肤屏障的修复。

2.3微生物组

皮肤的主要功能是作为天然屏障阻隔人体与外界的接触，其表面栖息着大量的微生物群，分为常驻菌群与暂住菌群[26]。常驻菌群在皮肤表面形成生物膜，一方面具有占位保护效应，作为物理屏障阻挡外源性致病菌的入侵；另一方面还可通过产生抗菌肽而抑制或杀灭病原菌。皮肤表面的微生物、宿主及外环境三者的相互作用形成了皮肤微生态环境[27]。影响皮肤微生态平衡的因素很多，如皮脂腺分泌物浓度、水分含量、温度，以及遗传和环境因素等[28]。皮肤微生态平衡被打破时，可引起脂溢性皮炎、痤疮、银屑病等皮肤问题[29]。确定皮肤中存在何种细菌的传统方法是使用拭子取样。采样技术的关键：使用湿润的棉签，施加稳定的压力，以及摩擦的一致性（在采样区域30 s内来回擦拭50次）[30]。Liu等[31]研究发现，连续使用含防腐剂的面膜会严重干扰人体面颊部微生态平衡，而连续使用无防腐剂面膜对人体面颊部微生态平衡无显著影响，可见化妆品中的防腐剂对维持皮肤微生态平衡具有重要的影响。潜艇海底密闭舱室环境特殊，人体表面微生物分布特征可能存在差异，Xu等[32]研究军人面部微生物分布发现，任务中后期与任务前期相比，优势条件致病菌（鲍氏不动杆菌）和栖居菌（滕黄微球菌、奥斯陆莫拉菌等）均明显增多，因此可根据军人所处的任务阶段储备不同护肤品及药品。痤疮的发生与皮肤表面微生物屏障的关系密切。He等[33]探讨寻常痤疮与正常人皮肤表面微生物的差异及细菌耐药性问题，结果显示寻常痤疮患者皮肤表面的痤疮丙酸杆菌对抗生素的耐药率高于正常人。Zouboulis等[34]研究发现痤疮丙酸杆菌可将甘油三酯水解为游离脂肪酸，这些游离脂肪酸被氧化形成过氧化脂质激活角质形成细胞的脂氧合酶，使IL-6等炎症因子分泌增加，促发并加重炎症反应。另外，痤疮丙酸杆菌可形成生物膜，这种生物膜在体内具有较强的抵抗外界环境及抗生素的作用，并且可以促进微粉刺的形成[35]。Wang等[36]将痤疮患者鼻部皮肤微生物与痤疮丙酸杆菌共同培养后发现痤疮丙酸杆菌被抑制，通过菌株鉴定后确认是表皮葡萄球菌抑制了痤疮丙酸杆菌，其机制是表皮葡萄球菌通过发酵甘油产生琥珀酸降低细胞内pH从而抑制痤疮丙酸杆菌，故提出琥珀酸可能成为一种治疗痤疮的新手段。研究发现痤疮丙酸杆菌是形成痤疮的因素之一[37]。通过使用皮肤生理学检测方法研究皮肤表面微生物，可以对宣称改善痤疮化妆品的功效性进行深入了解。

2.4功能组

在对功能组皮肤指标进行检测时大多使用D-Squame®粘贴盘进行采样，采样后对胶带直接进行染色，通过图像分析进行物质定量，或采用高效液相色谱法检测胶带上相应物质的含量。

蛋白羰基化是羰基化合物对蛋白质的修饰过程，蛋白羰基化的积累会导致皮肤角质层透明度的下降，保水能力的不足，并且会导致真皮层弹性纤维以及胶原蛋白的变性[38]。真皮层蛋白羰基化产物的积累会导致皮肤的颜色发黄[39]。丙二醛（malondialdehyde,MDA）是脂质过氧化物的一种，作为脂质过氧化的终端产物，MDA具有很强的交联特性。MDA在细胞中可以和蛋白、核酸以及脂质形成不溶性物质，进而导致皮肤的一系列氧化损伤。最近在墨西哥城进行的一项临床研究显示，皮肤在应对环境污染时，多个皮肤生物化学及生理学参数发生了显著性改变，如皮脂分泌率增加、皮脂内维生素E和角鲨烯的含量降低、乳酸增加以及蛋白羰基化水平增高[12]。Che等[40]研究发现UVA辐射组的皮肤蛋白羰基化水平显著高于未暴露区，且雾霾等环境暴露也会显著提高皮肤的蛋白羰基化水平。细胞水平检测MDA的含量，UVB辐照组与未辐照组具有明显的差异，在人体皮肤表面通过胶贴采样发现，MDA的含量变化与皮肤暴露时间及衰老程度有密切联系。Jiang等[41]通过胶贴采样方法研究空气污染对人前臂屈侧皮肤角质层蛋白羰基化的影响，结果发现，空气污染会加剧皮肤角质层的蛋白羰基化损伤，而粉红胡椒木提取物和脂质混合物能有效降低暴露部位的蛋白羰基化水平。

维生素E(vitamin E,VE）是存在于皮肤中的一种脂质抗氧化物，是公认的抗氧化剂。VE主要有4种类型（α-，β-，γ-，δ-），其中α-VE的抗氧化能力最高[42]。VE对皮肤具有光保护作用，可以有效地减少光损伤的细胞数量、减少UVB辐照的伤害[43]。VE可以明显抑制皮肤脂质过氧化物的反应、清除自由基，有效地减少过氧化物的生成，进一步维持了细胞膜的正常功能；VE还参与了线粒体的呼吸，以及细胞色素的形成过程，对提高机体的免疫以及抗衰功能都有促进作用[44]。在光老化过程中，皮肤最外层VE是最先感受到皮肤刺激的抗氧化物质。有研究[45]表明，随着光老化程度的增加，皮肤中VE的含量会显著降低，并且皮肤角质层中的MDA水平会随之升高。

天然保湿因子（natural moisturizing factor,NMF）是存在于人体皮肤角质层的一种具有保水作用的吸附性水溶性物质，成分主要是氨基酸、吡咯烷酮羧酸、乳酸、尿素、尿酸、无机盐等。NMF中的吡咯烷酮羧酸（pyrrolidone carboxylic acid,PCA）是存在于皮肤角质层中的一类重要的天然保湿因子，是皮肤自身内源性生水功能的重要参与者，增加皮肤持水率，保持皮肤弹性和水润度，是肌肤供水之源。尿刊酸（urocanic acid,UCA）是组氨酸的代谢产物，也是表皮中另一种重要的天然保湿因子。UCA含量降低与皮肤干燥、色斑沉积、皮肤表面的pH值有直接关系。天然保湿因子能在角质层中与水结合，并通过调节、贮存水分达到保持角质细胞间含水量的作用，使皮肤自然呈现水润状态。若天然保湿因子缺乏或不健全，便会造成肤色暗沉，产生细纹并使皮肤变得干燥、敏感。Son等[46]通过使用胶带剥离法提取皮肤角质层的NMF，并通过高效液相色谱法检测胶带上的NMF含量，结果显示干性皮肤中的NMF与正常皮肤相比显著降低。Binder等[47]研发了一款基于非离子硅表面活性剂的新型水包油乳液，受试者在连续使用4周后皮肤角质层NMF的含量显著增加。

在人类表皮中黑素细胞位于表皮基底层，每个黑素细胞被周围大约36个角质形成细胞包围，形成所谓的“表皮黑素单位”。黑素细胞胞浆含有特征性黑素小体（melanosome），是黑素合成的场所。黑素细胞通过其树枝状突起向周围表皮黑素单位输送黑色素[48]。一旦进入角质形成细胞，黑素小体分布至细胞核DNA上方，形成保护屏障，保护皮肤免受紫外辐射损伤。黑素细胞及黑素合成过程在皮肤生理功能中发挥重要作用[49]。黑素细胞目前研究最多、最明确的功能是合成黑色素，赋予皮肤和毛发颜色，保护DNA免受紫外线辐射引起的损伤[50]。Lu等[51]研究紫外照射对浅表皮层细胞黑素含量和分布的影响，在紫外照射前后通过胶带粘贴采集受试部位浅表皮层细胞，分析发现紫外照射一周后，浅表皮层细胞黑素含量明显增加，且细胞内黑素颗粒增大、颜色加深，黑素颗粒倾向聚集于细胞中心。Wang等[52]通过使用胶带粘贴法对接受窄谱中波紫外线（NB-UVB）治疗的白癜风皮损进行浅表角质层细胞取样，分析发现治疗30次后细胞内黑素颗粒面积百分比相比治疗前及治疗10次后均显著增高。

目前皮肤生理学检测可以检测多组学指标，应用广泛，在化妆品功效评价中不同的功效宣称可以综合不同的皮肤生理学检测指标来评价，具体如表1所示。

表 1 化妆品功效评价常用的皮肤生理学检测指标

3、结束语

皮肤生理学检测通过皮肤胶贴采样进行相关指标的体外检测和表征，既可以对临床功效评估方法体系进行补充，实现检测结果的客观性、科学性和高通量，又可以获取对产品功效的基础数据支持，对企业寻找新的产品功效宣称点具有重要意义。相对于其他化妆品功效评价方法，皮肤生理学检测是多维度、多指标的测量方法，可发现皮肤问题的根源，明确皮肤细胞靶点，为定制护肤提供科学数据。使用皮肤生理学检测技术，可以了解到不同人群皮肤存在差异的原因、健康与亚健康皮肤存在差异的具体体现、深层表征皮肤差异的指标含义以及企业如何指导面向消费者皮肤差异的化妆品开发等问题。目前皮肤生理学检测的指标尚不全面，需要与其他人体功效评价方法相结合，才能实现对化妆品功效系统性的评价。利用生理学、生物学、化学等相关学科的新技术、新方法、新理念，拓展皮肤生理学检测的指标，提高检测精度，是皮肤生理学检测的重要发展方向。

马雪,宋艳青,盘瑶,赵华,卢永波,范展华.化妆品功效评价（Ⅻ）——皮肤生理学检测在化妆品功效评价中的应用[J].日用化学工业,2020,50(01):14-19.

基金:国家自然科学基金资助项目(81903361);北京市教育委员会科技计划一般项目资助(KM201810011008).