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TET基因与5-羟甲基胞嘧啶在慢性鼻窦炎中的表达

2020-12-31 263 上传者：管理员

摘要：目的:探讨TET基因和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)在慢性鼻窦炎(CRS)中的表达及临床意义。方法:获取20例CRS伴鼻息肉患者的息肉组织(CRSwNP组),20例CRS不伴鼻息肉患者的钩突组织(CRSsNP组)和10例鼻中隔偏曲患者的中鼻甲组织(对照组)。通过免疫荧光技术、Western-Blot和实时荧光定量PCR检测TET基因和5hmC在CRS中的表达。结果:TET1/2/3基因和5hmC在CRSsNP组中均有较高表达,在CRSwNP组和对照组中表达较低,CRSsNP组与CRSwNP组和对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);CRSwNP组中TET1与TET3的表达显著低于对照组(P<0.05)。结论:DNA去甲基化在鼻息肉的形成中有着重要作用,TET1、TET2、TET3和5hmC的高表达可能降低鼻息肉形成风险;CRS中DNA去甲基化增加有可能降低鼻息肉形成风险,当CRS中DNA甲基化程度较高、DNA去甲基化程度较低时疾病可能向CRSwNP发展,而当DNA甲基化程度较低、DNA去甲基化程度较高时则可能发展为CRSsNP。

关键词：
TET蛋白
甲基化
羟甲基胞嘧啶
鼻疾病
鼻窦炎
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慢性鼻窦炎(CRS)是指鼻与鼻窦黏膜的慢性炎症[1]。根据表型,CRS可分为CRS伴鼻息肉和CRS不伴鼻息肉两类。其中CRSwNP还分为嗜酸性CRSwNP和非嗜酸性CRSwNP两类[2,3]。最新研究表明,表观遗传学不仅在肿瘤领域有着重要作用,在CRS、哮喘、变应性鼻炎等呼吸道炎症疾病中也有着重要的作用[4,5]。糖皮质激素是治疗CRS的重要药物,而最新研究发现糖皮质激素可以影响鼻腔细胞的DNA甲基化,从而改善炎症反应[6]。因此研究CRS的表观遗传学变化对揭示CRS的发病机制有着重要的意义。DNA甲基化是常见的表观遗传修饰方式,目前CRSDNA甲基化的研究较多,而关于去甲基化的研究较少,DNA去甲基化是指DNA胞嘧啶的第5位碳原子上的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mc)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC),从而使基因获得转录活性,该过程受到TET(ten-eleventranslocation)蛋白的催化,是机体对DNA甲基化水平的一种主动调控方式,也是调控基因表达的一种重要手段。本实验通过检测CRS中5hmC表达以及TET基因的变化情况之间的关系,以初步探讨鼻窦炎的表观遗传调控机制。

1、资料与方法

1.1临床资料

获取2018年9月-2019年9月我科20例CRSwNP患者(CRSwNP组)鼻息肉组织,20例CRSsNP患者(CRSsNP组)钩突组织和10例鼻中隔偏曲患者(对照组)中鼻甲组织。手术中取出标本后分为两份,一份立即放入液氮中,然后转移到-80℃冰箱保存;一份放入甲醛中保存,用于制作石蜡切片。诊断标准参照中国CRS诊断和治疗指南[1]。排除标准:手术前4周内接受抗生素和糖皮质激素治疗,患有囊性纤维化、阿司匹林耐受不良、肿瘤、免疫缺陷或其他遗传性疾病。所有患者均在术前签署标本采集知情同意书,且本研究获武汉大学人民医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂

TET2、TET3抗体(CellSignalingTechnology,美国),TET1抗体(SangonBiotech,中国),Takara试剂盒(Takara,日本),5hmC抗体(CellSignalingTechnology,美国)

1.3免疫荧光

将切片置于65℃烤箱中烘烤3h,按顺序进行二甲苯脱蜡,柠檬酸钠抗原修复,Triton破膜处理,3%过氧化氢液去除内源性酶,5%BSA封闭,加入5hmC一抗(稀释1∶400)4℃避光孵育过夜,二抗室温孵育1h,DAPI染色5min,滴入适量抗荧光淬灭剂,封片。

1.4免疫荧光半定量分析

5hmC的强度通过ImageJ软件进行荧光半定量分析,在ImageJ软件中打开荧光图像,然后将其转换为灰度图像,并将其颜色反转。再对光密度进行校准,然后选择荧光表达的范围,测量细胞的平均光密度(IOD)和面积大小,“总IOD/总面积”的值代表免疫荧光的强度。

1.5总RNA提取

将组织标本放入研磨仪中,加入1000μLTrizol试剂研磨30s,静止10min后转入1.5mL离心管,加入200μL氯仿,充分震荡后静止5min,4℃12000r/min离心15min,吸取上层清液置于1.5mL离心管,加入等量异丙醇,混匀后静止10min,4℃12000r/min离心15min,弃上清,加入75%乙醇DEPC水1mL,吹打混匀,4℃10000r/min离心10min,弃上清,吸干管内残留液体,室温干燥后,根据沉淀加入适量DEPC水溶解,溶液即为RNA提取液,以上操作皆在冰上进行。

1.6实时荧光定量PCR

按Takara试剂盒进行实时荧光定量PCR反应,将提取的RNA进行去除基因组DNA反应后进行逆转录反应,反应条件:37℃下进行15min,然后在85℃下5s。定量反应在CFX9Real-TimePCR中进行,反应条件:在95℃持续30s;在95℃持续5s,在55℃持续30s,在72℃持续1min,此三步循环39次。表1为被检测基因(TET1/2/3和GAPDH)的引物序列。

表1使用荧光定量PCR的引物序列和退火温度

1.7TET蛋白的Western-Blot检测

将组织进行液氮研磨后加入1mmol/L裂解液于冰上孵育0.5h,裂解细胞。使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳,PVDF转膜。采用含5%脱脂牛奶的TBST,室温封闭1h。加入一抗,抗TET1/2/3(稀释1:1000)在4℃过夜。TBST洗涤后,印迹与二抗体孵育在室温下1h。使用QuantityOne软件对蛋白进行定量分析。

1.8统计学处理

实验的所有数据均采用SPSS16.0软件进行统计学分析,2组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组组织中5hmC的免疫荧光中表达水平

免疫荧光结果显示,5hmC在各组组织中均有表达。3组间表达强度有显著差异,两两比较显示,CRSsNP组中的5hmC荧光表达显著高于CRSwNP组和对照组(P<0.05),说明与CRSsNP相比,CRSwNP组存在较低的去甲基化水平,见图1、2。

2.2TET的实时荧光定量PCR检测

TET的实时荧光定量PCR检测结果显示,TET1、TET2、TET3在3组组织中均有表达。CRSwNP组的TET1、TET2、TET3的表达均显著低于CRSsNP组;与对照组相比,CRSsNP组在TET1、TET2、TET3三个基因的表达上差异有统计学意义(P<0.05)。CRSwNP组与对照组相比,TET1、TET2、TET3的表达差异均无统计学意义(P>0.05),见图3。

2.3TET蛋白Western-Blot检测

TET蛋白Western-Blot检测结果显示,TET1、TET2、TET3蛋白在3组中均有表达。与对照组及CRSsNP组相比,CRSwNP组TET1和TET3蛋白的表达较低(P<0.05),而TET2蛋白表达无显著差异。与CRSwNP组和对照组相比,CRSsNP组的蛋白表达水平较高(P<0.05),见图4。

图1各组5hmC的免疫荧光表达水平

图23组定量5hmC荧光信号强度比较

图3各组中TET基因的相对表达水平

图43组中TET蛋白的相对表达水平及蛋白定量分析

3、讨论

CRS是常见的慢性疾病之一,影响全球4%～10%人群的健康[7]。研究发现DNA甲基化的改变可能与CRS病理生理的相关变化有着紧密的联系[8]。5hmC常常分布在哺乳动物常染色体区域,特别是在启动子、外显子区域、远端顺式作用元件,这些区域与基因转录活性有重要联系,因而5hmC被认为是一个稳定的去甲基化标志。因此通过检测CRS组织中的5hmC表达水平,可以检测CRS的去甲基化水平。TET蛋白是Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶,可以催化5mC逐步氧化为5hmC、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)[9],促进主动去甲基化。越来越多的证据表明,TET酶在调节基因表达,促进细胞分化和抑制肿瘤形成中起着至关重要的作用。

基因去甲基化在表观遗传调控中的作用近年来颇受重视。哮喘和变应性鼻炎均为呼吸道疾病,其发病机制都已被发现与去甲基化有关。Li等[10]研究显示在变应性鼻炎患者的外周血单核细胞中TET1、TET3和5hmC表达增高。在哮喘患者的鼻气道上皮细胞中TET1表达和总体5hmC水平较高[11]。在尘螨诱导的气道高反应性小鼠模型中,小鼠肺部组织的去甲基化水平也增加[12]。CRS与哮喘和变应性鼻炎均为呼吸道疾病,尚未有文献报道基因去甲基化在CRS中的作用。本研究中,我们发现在CRSsNP组中TET1、TET2、TET3和5hmC中表达一致,都有较高的表达水平,这表明TET和DNA去甲基化在CRSsNP的病理过程中起重要作用。CRSwNP和对照组中TET1、TET2、TET3和5hmC的表达一致,都表现出较低水平的表达。但我们在实验中发现CRSwNP和对照组中TET1和TET3的蛋白表达存在显著差异,而其TET1和TET3的基因表达和5hmC的表达却一致。导致这种差异的具体原因并不清楚,不过有研究发现鼻息肉形成中涉及的关键基因受到环境因素的影响[7]。在本实验中我们还发现在CRSwNP组中部分病例的5hmC荧光表达强度较高。根据苏木精-伊红染色分析,这一部分病例为嗜酸性CRSwNP,但由于例数较少,我们没有对嗜酸性CRSwNP和非嗜酸性CRSwNP的5hmC和TETs表达进行分组统计学分析。

已有研究表明DNA甲基化在CRS的息肉形成中有着重要的作用。Kidoguchi等[13]发现,在CRS中PLAT基因近端启动子的DNA甲基化有助于息肉的形成。Li等[14]研究发现,与CRSsNP相比,CRSwNP中胸腺基质淋巴细胞生成素基因座的DNA甲基化水平显著增高。Zheng等[15]通过DNA甲基化芯片鉴定了鼻息肉样品中表达显著改变的4个基因(COL18A1,EP300,GNAS和SMURF1),发现上述基因的启动子都发生了甲基化。本研究发现,与CRSsNP组相比,CRSwNP组的TET1、TET2、TET3和5hmC的表达均较低,因此CRSwNP中息肉的形成可能与DNA甲基化增加和去甲基化降低有关。结合文献及本研究结果提示,当CRS中DNA甲基化程度较高、DNA去甲基化程度较低时疾病可能向CRSwNP发展,而当DNA甲基化程度较低、DNA去甲基化程度较高时则可能发展为CRSsNP。

目前的研究已经表明表观遗传学在CRS的发病机制中有着重要的作用,鼻息肉的形成与DNA甲基化有着紧密的联系。本研究也有着一定的局限性,实验中未对CRSwNP组、CRSsNP组和对照组中DNA甲基化程度进行检测,未将CRSwNP组中的2种重要亚型嗜酸性CRSwNP和非嗜酸性CRSwNP进行对比研究。总之,本实验表明了DNA去甲基化可能与CRS的发病机制和鼻息肉的形成有关。但是关于DNA去甲基化相关的基因位点以及DNA去甲基化如何具体影响CRS发病的机制仍不清楚,亟待深入研究。

参考文献：

[1]中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会,中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南[J].中华医学信息导报,2009,24(8):21-22.

姚冲,许昱.TET基因与5-羟甲基胞嘧啶在慢性鼻窦炎中的表达及意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2021,35(01):52-56.