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葛根芩连汤干预肥胖2型糖尿病前期肝脏脂肪异位沉积脂质代谢

2025-02-12 120 上传者：管理员

摘要：目的：考察葛根芩连汤(GQD)灌胃干预肥胖2型糖尿病前期肝脏脂肪异位沉积的脂质代谢机制。方法：采用SD大鼠建立肥胖 2 型糖尿病前期模型。造模成功后，将大鼠随机分为模型组、罗格列酮组、GQD高剂量组、GQD中剂量组、GQD低剂量组，模型组和正常组每天灌胃生理盐水、罗格列酮组(5 mg/kg)，GQD高、中、低剂量组以生药浓度为14.85、4.85、1.65 g/kg灌胃，持续给药16周后，眼眶取血，以检测血糖指标和生化指标，并观察肝组织脂肪聚集情况。采用 UPLC-Q-TOF/MS技术对样本进行检测，对各组结果进行主成分分析法和正交偏最小二乘判别分析，筛选并鉴定差异代谢物，对已鉴定到的生物标志物进行通路分析。结果：高脂饲料饲养16 周后，与正常组比较，模型组体重、空腹血糖、胰岛素抵抗(IR)指数均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，GQD高、中、低剂量组均能降低空腹血糖和IR指数。油红O染色的肝脏病理切片结果显示，模型组存在大量脂质，给药组大鼠肝脏组织有所改善；葛根芩连汤干预模型大鼠的脂类生物标记物相关通路主要涉及调节甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、初级胆汁酸生物合成代谢等通路。结论：GQD对肥胖2型糖尿病前期的肝脏脂肪异位沉积具有显著改善作用。

关键词：
2型糖尿病前期
异位沉积
肝脏脂肪
脂质代谢
葛根芩连汤
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糖尿病前期是具有可逆性的2型糖尿病（T2DM）的必经阶段，对其进行干预治疗是预防糖尿病发生的关键。中医药对T2DM的治疗以及预防均有良好效果，课题组前期研究结果显示，葛根芩连汤（GQD）可以降低血糖和改善高脂饮食引起的胰岛素抵抗（IR）［1-2］。本课题组在诱导成肥胖T2DM前期的基础上，观察肝脏脂肪异位沉积和对肝脏炎症因子及氧化应激，从脂质代谢组角度阐述肝脏脂肪异位沉积与糖尿病前期IR关系，阐述糖尿病前期IR可能的发病机制［3］。本研究通过高脂饲料饲养建立肥胖T2DM前期大鼠模型，GQD灌胃给药干预，肥胖型大鼠的血糖异常得到改善。使用肝脏脂质组学的分析方法，将大鼠肝脏作为实验样本，从而探究GQD干预肥胖T2DM前期代谢的机制，为临床预防提供依据。

1、材料与仪器

1.1动物雄性SD大鼠36只（SPF级），6~7周龄，体质量180~220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产合格证号：SCXK（京）2016-0011，动物饲养于江西中医药大学动物科技中心屏障系统，饲养条件：室温为（22±2）℃，相对湿度为40％~60％，自由摄食、饮水；高脂饲料（批号D12492，含脂肪60％、蛋白质20％、糖类20％）、普通饲料（批号D12450J），均购于无锡帆泊生物技术有限公司；动物伦理批准号JZLLSC20210063。

1.2药物GQD

由葛根（批号180124）、黄芩（批号171215）、黄连（批号180131）、炙甘草（批号171214）组成，以上饮片均购于江中中药饮片有限公司，罗格列酮（成都恒瑞制药有限公司，批号H20060578，1 mg）。

1.3试剂油

红O染色试剂（批号80109218，武汉皮诺飞生物科技有限公司）；ELISA试剂盒（批号H21Y11，上海恒远生物有限公司）；甲醇、乙腈（德国Merk公司）；甲酸（美国Dikma Pure公司）；异丙醇（西陇科学股份有限公司）。

1.4主要仪器

GENO 2010型高通量冷冻组织研磨仪（SPEXSample Pre公司）；正置光学显微镜（日本尼康）；高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Acquity UPLC液相色谱系统、Q-TOF SYNAPTG2 HDMS质谱仪（美国Waters公司）。

2、方法

2.1动物分组、造模、给药

36只大鼠经过1周的适应性喂养后，按照体重大小，被随机分成正常组（6只）和造模组（30只）进行喂养。分别喂食普通饲料和高脂饲料，造模组大鼠在喂养16周后，眼眶采血，其中30只大鼠空腹血糖比正常组高，胰岛素抵抗指数具有显著性差异，造模成功率为100%［3］，将模型大鼠按体重大小随机分为模型组、罗格列酮组、GQD高剂量组、GQD中剂量组、GQD低剂量组，每组6只，均继续给予高脂饲料。模型组和正常组每天灌胃生理盐水，罗格列酮组（5 mg/kg），GQD高、中、低剂量组以生药浓度为14.85、4.85、1.65 g/kg灌胃给药，灌胃量为10 mL/kg。持续给药16周后，眼眶取血，以检测血糖指标［4］。

2.2体重和生化指标

高脂饲料喂食16周后，大鼠称重，禁食12 h，眼眶采血1 mL，全血样本4℃静置3 h后，离心15 min（4℃，3 000 r/min），吸取上层血清，以检测空腹血糖、空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗（IR）指数。

2.3肝脏样品采集与肝脏样品脂质组预处理

大鼠取血后摘取肝脏，存放于-80℃超低温冰箱中，用时在4℃的冰箱中解冻，通过甲基叔丁基醚的方法提取脂类［5-6］。取肝组织50 mg，加入300μL甲醇匀浆5 min，加入甲基叔丁基醚1 mL，纯水250μL，4℃冰箱静置1 h，离心15 min（12 000 r/min，4℃），取上清溶液至1.5 mL EP管中，真空浓缩后，-80℃保存；解冻后加入400μL甲醇定容，涡旋混合1 min，离心15 min（12 000 r/min，4℃）后，取200μL上清液至进样瓶，进样分析。

2.4观察肝组织脂肪聚集情况

取部分肝组织，通过冷冻切割、油红O染色和光学显微镜下观察肝组织的脂肪聚集情况。

2.5 UPLC-Q-TOF/MS检测

2.5.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；柱温为40℃ ；样品室温度为10℃ ；流动相试剂：A为乙腈∶水=40∶60（0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵），B为异丙醇∶乙腈=90∶10（0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵）。梯度洗脱条件（0~2 min，1% B；2~5 min，1%→65% B；5~15 min，65%→99% B；15~17.1 min，99%→1% B）；流速：0.3 mL/min；进样量：3 μL。

2.5.2 质谱条件

正离子模式扫描，电压：3.0 kV，离子源温度为120℃，采集质量数范围：50~1 500 Da；采用质控（QC）样品，先采集6次QC样品信息，平衡色谱柱，在后续样品信息采集中，每8个样品中加1针QC采集，用于考察系统稳定性。

2.6脂质组学数据处理与分析

通过MassLynx 4.1采集样本信息，得到样品总离子流图（TIC）；采集的谱图通过Progenesis QI进行峰值提取、峰值对齐等处理，就可以获得csv格式文件，其中包括保留时间（RT）和质荷比（m/z）。将通过处理的数据导入到SIMCA 14.1，通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析，筛选变量投影重要性分析（VIP）值>1，再代入人类代谢组数据库（HMDB）进行鉴定，利用MetaboAnalyst 5.0对已鉴定到的物质进行代谢路径分析。

2.7统计学方法

采用Graph Pad Prism 8.0统计软件分析数据，结果以均数 ± 标准差（x s± ）表示，t检验比较两组间差异，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1造模阶段生化指标的变化

造模16周后，造模组大鼠体重、空腹血糖、IR指数均高于正常组（P<0.05），表明造模成功。见表1。

表1大鼠体重、空腹血糖、空腹胰岛素和IR指数的变化

3.2给药后生化指标的变化

给药16周后，与正常组比较，模型组体重、空腹血糖、IR指数均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，GQD高、中、低剂量组均能显著降低空腹血糖和IR指数（P<0.05）。见表2。

表2各组大鼠体重、空腹血糖、IR指数的变化

3.3葛根芩连汤对肝脏组织脂肪聚集的影响

正常组大鼠肝细胞形态正常，细胞核呈蓝色，未见红色脂滴的产生；而模型组大鼠肝细胞形态异常，细胞质内可见大量大小不等的鲜红脂滴；GQD各剂量组与模型组比较，肝组织中的脂滴显著减少，肝组织细胞情况也有了显著改善。由此可见GQD可改善大鼠肝脏脂肪异位沉积的程度。见图1。

图1各组肝脏油红O染色图

3.4大鼠肝脏脂质组学代谢图谱UPLC-Q-TOF/MS技术在正模式下对肝脏样品进行全扫描，获取肝脏样品化合物质谱信息。

3.5 QC样本稳定性考察

在正离子模式下，QC样本相关性R2均大于0.99，接近于1，表明在样品采集过程中，仪器运行稳定。

3.6大鼠肝脏脂质组OPLS-DA分析

考察造模后大鼠肝脏中内源性代谢产物的差异及GQD的干预作用，寻找差异代谢物，运用OPLS-DA分别对正常组和模型组、模型组和GQD各剂量组进行分析，得到各组的OPLS-DA得分图，正常组与模型组明显分开，表明造模成功，GQD各剂量组与模型组明显分开，表明GQD可以显著回调糖尿病前期大鼠肝脏中内源性脂质代谢产物，且治疗效果明显。见图2。

3.7大鼠肝脏OPLS-DA判别模型验证

重复200次排列置换验证，纵坐标上Q2回归线截距小于0，说明该模型具有很高的稳定性，没有过拟合现象。见图3。

图2正离子模式下各组与模型组大鼠肝脏OPLS-DA得分图

图3正离子模式下与模型组大鼠肝脏的判别模型验证图

3.8肝脏脂肪异位沉积内源性代谢物含量变化

在给药阶段，潜在生物标志物的含量发生变化，与正常组比较，模型组样品中有20种物质的含量发生了变化，其中甘油二酯、甘油三酯、葡糖基神经酰胺、磷脂酰胆碱等物质的含量显著上调（P<0.05）；而2-(14,15-Epoxyeicosatrienoyl) Glycerol的含量显著下调，GQD对上述生物标记物具有回调作用（P<0.05）。

3.8.1 给药后肝脏脂质代谢物热图分析

通过将20种不同脂质代谢物进行分层聚类，热图分析结果表明，各组脂质代谢产物之间的显著差异。见图4。图4 各组大鼠肝脏的脂质差异物热图

3.8.2 给药后肝脏脂质代谢物潜在生物标志物通路分析

将鉴定出的20种潜在生物标志物带入MetaboAnalyst 5.0进行路径分析。见图5。

图5大鼠肝脏代谢通路分析

4、讨论

高脂饲料饲养16周后，大鼠空腹血糖、IR指数均显著性升高，给药16周后GQD高、中、低剂量均能降低空腹血糖，其中GQD高低剂量具有显著性差异。油红O染色的肝脏病理切片结果显示，模型组存在大量脂质，给药组大鼠肝脏组织有所改善。为了探讨葛根芩连汤干预肥胖T2DM前期的机制，通过对大鼠肝脏脂质组的分析，发现了20个生物标记物，并对它们的代谢途径进行了分析，结果表明，这些生物标记物大致（下转第66页）涉及7个新陈代谢途径［7-9］，分别是甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成代谢、鞘脂、亚油酸代谢、初级胆汁酸生物合成代谢。磷脂酰胆碱参与4条代谢路径：甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢和花生四烯酸代谢；磷脂酰乙醇胺参与3条代谢路径：甘油磷脂和糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成代谢，GlcCer参与鞘脂代谢，甘氨胆酸参与初级胆汁酸生物合成代谢。脂质组学的研究进一步证明，GQD干预肥胖T2DM前期的机制与改善肝脏脂质含量变化密切相关。GQD-高、中、低剂量可显著降低空腹血糖、IR指数，通过大鼠肝脏油红染色和肝脏炎症因子及氧化指标可知，GQD对肥胖T2DM前期的肝脏脂肪异位沉积具有显著改善作用，对肝脏组织发生的炎症反应及氧化应激都有显著回调，表明GQD具有抗炎、抗氧化作用。根据大鼠肝脏脂质组学研究发现，GQD在肥胖T2DM前期中发挥着重要作用，其机制主要与调节甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、初级胆汁酸生物合成代谢等通路有关。这些发现可提高对糖尿病前期IR的认识，并通过改善肝脏脂肪异位沉积帮助治疗T2DM。

参考文献:

[1]周子妍,曾国威,盛译萱,等.葛根芩连汤干预2型糖尿病前期大鼠的代谢机制研究[J].中药新药与临床药理, 2021, 32(2): 245-251.

[3]高金青,许清松,方永青,等.肥胖2型糖尿病前期肝脏脂肪异位沉积的脂质代谢研究[J].中药药理与临床, 2023, 39(7): 74-81.

[4]刘海云,占诗梦,彭淑红,等.葛根芩连汤对肥胖2型糖尿病前期胰岛素抵抗伴缺氧大鼠肾组织HIF- 2α､EPO及GILUT4表达的影响[J].中药药理与临床, 2024, 40(1): 3-7.

[8]李亚琴,张俊,贺春娥.甘胆酸与丙氨酸氨基转移酶检测的临床应用[J].临床输血与检验, 2004, 6(2): 119-120.

基金资助:江西省卫健委科技计划项目(202211417);国家自然科学基金项目(82060826);

文章来源:张启云,高金青,姜丽,等.葛根芩连汤干预肥胖2型糖尿病前期肝脏脂肪异位沉积的脂质代谢研究[J].江西中医药,2025,56(02):59-62+66.