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在无血清悬浮培养MDCK细胞上乙型流感病毒增殖条件的优化

2020-05-25 478 上传者：管理员

摘要：目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞，对培养条件中的MOI(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）、胰酶终浓度（2.5、5、7.5、10、15、20μg/mL）、细胞接毒密度（50×104、100×104、300×104、500×104、700×104个/mL）及病毒收获时间（24、48、72、96、120h）进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为：MOI为10-2、胰酶终浓度为10μg/mL、细胞接毒密度为300×104个/mL、病毒收获时间为72h。流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度（CCID50）均明显高于贴壁培养的MDCK细胞（P<0.05）。结论优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件，为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。

关键词：
HA血凝滴度
MDCK细胞
悬浮培养
流感病毒
病毒学
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流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道感染[1]，易在人群中造成大流行[2,3,4]，接种流感疫苗是预防流感病毒感染的主要控制措施之一[5]。目前已上市的流感疫苗大多是采用鸡胚生产[6]，该工艺成熟，经验丰富，但鸡胚的使用存在较多问题，如易受外源因子污染、蛋白过敏反应多、病毒在培养过程中易变异、流感大暴发时鸡胚供应困难等[7]。因此，以细胞培养法代替鸡胚生产流感疫苗成为近年流感疫苗的研发趋势。细胞培养法具有易于放大规模及质量控制、迅速适应市场等优点，是流感疫苗的良好生产基质[8,9]。MDCK细胞培养可分为贴壁培养和无血清悬浮培养。与贴壁培养比较，悬浮培养不使用血清，减少了外源因子污染；无需消化和贴壁，简化了操作步骤；大规模培养时无需使用昂贵的微载体，从而降低了成本；不受贴壁基质和接触面积的限制，提高了设备利用率，易于扩大培养规模。

本研究通过在不同条件下以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞，探讨MOI、胰酶终浓度、细胞接毒密度和病毒收获时间对病毒增殖的影响，优化流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件，为后续采用生物反应器大量制备细胞基质的流感疫苗奠定基础。

1、材料与方法

1.1细胞及病毒

两株MDCK细胞均源自欧洲细胞株/微生物保藏中心（EuropeanCollectionofCellCultures,ECACC），其中用于无血清悬浮培养的MDCK细胞株编号为02050101，用于贴壁培养的MDCK细胞株编号为84121903，前者是由ECACC将后者经无血清悬浮驯化而来；适应MDCK细胞的乙型流感病毒流行株B/Brisbane/60/2008(NYMCBX-35）及1%鸡红细胞悬液由长春生物制品研究所提供。

1.2主要试剂

VirusPro誖MDCK-S细胞无血清培养基购自上海源培生物科技公司；DMEM购自美国Gibco公司；新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；TPCK胰蛋白酶购自美国Sigma公司；3%L-Gln溶液、8%NaHCO3溶液、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）及0.25%胰蛋白酶由长春生物制品研究所制备。

1.3细胞培养

1.3.1无血清悬浮细胞培养

从液氮中取出MDCK细胞（编号为02050101），于37℃水中迅速融化；184.5×g离心5min，用VirusPro誖MDCK-S细胞无血清培养基重悬，于37℃，120r/min摇床中培养48h，计数，以80×104个/mL的细胞密度进行传代，采用复苏后15代以内的细胞进行后续试验。

1.3.2贴壁细胞培养

从液氮中取出MDCK细胞（编号为84121903），于37℃水中迅速融化，接种至装有9mLDMEM培养基[DMEM+10%新生牛血清+0.6%NaHCO3溶液（8%)+1%L-Gln溶（3%）]的25cm2细胞培养瓶中，于37℃培养48h，用0.25%胰酶消化，按3×104个/cm2接种至细胞瓶，补加适量DMEM培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.4流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

将无血清悬浮培养的MDCK细胞液进行184.5×g离心5min，用病毒维持液（含8%NaHCO3和3%L-Gln的DMEM）重悬。

1.4.1不同MOI对流感病毒增殖影响的检测

调节细胞密度为300×104个/mL，加入终浓度5μg/mL的胰酶，按30mL/瓶分装至100mL摇瓶中，再将流感病毒分别按MOI=10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7接种，于33.5℃，120r/min摇床中培养。各组均设2个平行，每24h取样，96h后收获病毒，检测HA血凝滴度及活细胞密度，试验重复4次。

1.4.2不同胰酶终浓度对流感病毒增殖影响的检测

按1.4项方法制备MDCK细胞悬液，调整细胞密度为300×104个/mL，以30mL/瓶分装在100mL摇瓶中，分别加入终浓度2.5、5、7.5、10、15、20μg/mL的胰酶，按MOI=10-2接种流感病毒，培养条件及检测方法同1.4.1项。

1.4.3不同细胞接毒密度对流感病毒增殖影响的检测

细胞密度分别调整为50×104、100×104、300×104、500×104、700×104个/mL，以30mL/瓶分装在100mL摇瓶中，加入终浓度10μg/mL的胰酶，按MOI=10-2接种流感病毒，培养条件及检测方法同1.4.1项，仅检测HA血凝滴度。

1.4.4收获时间对流感病毒增殖影响的检测

调整细胞密度为300×104个/mL，按30mL/瓶分装在100mL摇瓶中，加入终浓度10μg/mL的胰酶，按MOI=10-2接种流感病毒，于33.5℃，120r/min摇床培养，分别于培养24、48、72、96、120h时收获病毒，检测HA血凝滴度。各组均设4个平行，试验重复2次。

1.5流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的比较

将无血清悬浮培养及贴壁培养的MDCK细胞数量均调整为6×107个，按MOI=10-2感染流感病毒，分别加入终浓度为10及2.5μg/mL的胰酶，于33.5℃，120r/min摇床培养72h，收获病毒液，检测HA血凝滴度及病毒滴度（CCID50）。各组均设3个平行，试验重复2次。

1.6统计学分析

应用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，MOI、胰酶浓度、细胞接毒密度和病毒收获时间优化结果采用单因素方差分析（one-wayANOVA），贴壁细胞与悬浮细胞比较结果采用独立样本T检验进行分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同MOI对流感病毒增殖的影响

感染72及96h，随着MOI的减小，病毒的HA血凝滴度呈先略上升再下降的趋势，组间差异均有统计学意义（F=7.37,P=0.024）。MOI为10-2时，感染72h的HA血凝滴度达最大值（10.73±0.25)log2(HAU/25μL);MOI<10-2时，感染72h的HA血凝滴度逐渐降低，且感染0～24h时病毒HA血凝滴度极低；当MOI>10-2时，感染0～24h时病毒HA血凝滴度最高，可达9log2(HAU/25μL），感染24～48h时HA血凝滴度略升高，72h时HA血凝滴度明显低于10-2组。MOI较高的情况下（10-1、10-2），活细胞密度在感染48h内迅速下降，且始终小于其他MOI条件下的活细胞密度。见图1。因此确定最适MOI为10-2。

图1不同MOI对流感病毒HA血凝滴度（A）及活细胞密度（B）的影响

2.2不同胰酶终浓度对流感病毒增殖的影响

随着胰酶终浓度逐渐增高，感染72及96h时，病毒的HA血凝滴度呈先上升后降低的趋势。胰酶终浓度为10μg/mL时，感染72h时病毒HA血凝滴度可达最高值（9.99±0.57)log2(HAU/25μL）；胰酶终浓度>10μg/mL时，HA血凝滴度降低，各组间HA血凝滴度差异无统计学意义（F=2.14,P=0.095）。随着胰酶终浓度的升高，活细胞密度降低。见图2。因此确定最适胰酶终浓度为10μg/mL。

图2不同胰酶终浓度对流感病毒HA血凝滴度（A）及MDCK活细胞密度（B）的影响

2.3不同细胞接毒密度对流感病毒增殖的影响

感染72及96h，各组间HA血凝滴度差异有统计学意义（F=9.04,P=0.030）。感染72h时，300×104个/mL组HA血凝滴度达最高值（10.6±0.73)log2(HAU/25μL）；细胞密度过小（50×104个/mL）或过大（700×104个/mL）时，HA血凝滴度均较低；细胞密度为（300～500）×104个/mL时，病毒HA血凝滴度较高，在该区间内，细胞密度越大病毒HA血凝滴度越低。见图3。因此确定300×104个/mL为最适细胞密度。

图3不同细胞接毒密度对流感病毒HA血凝滴度的影响

2.4收获时间对流感病毒增殖的影响

感染24、48、72、96、120h的HA血凝滴度分别为（8.23±0.48）、（9.67±0.44）、（10.56±0.49）、（9.60±0.47）、（9.23±0.64)log2(HAU/25μL）。随着感染时间的延长，HA血凝滴度逐渐升高，72h时达最高，随后呈下降趋势。各收获时间点间的HA血凝滴度差异有统计学意义（F=16.06,P=0.002）。因此确定最佳收获时间为72h。

2.5流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的比较

无血清悬浮培养及贴壁培养MDCK细胞感染流感病毒72h,HA血凝滴度分别为（9.87±0.09）和（8.11±0.15)log2(HAU/25μL），病毒滴度（CCID50）分别为（8.44±0.17）和（7.41±0.32)logCCID50/mL。前者的HA血凝滴度及病毒滴度（CCID50）均明显高于后者，且差异有统计学意义（F分别为192.2和16.13,P分别为0.026和0.015），表明采用优化后的病毒增殖条件可显著提高流感病毒的复制增殖。

3、讨论

本实验对流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件进行了优化，得到了较适宜的培养条件。

MOI指感染细胞时的流感病毒总数与被感染细胞总数的比值。MOI过小，前期感染细胞的病毒少，则病毒复制并产生大量病毒颗粒的速度慢，增加了病毒培养时间；MOI过大，感染前期病毒大量复制增殖，HA血凝滴度出现短暂的较快增长，但过高的MOI会使细胞产生大量感染性低的不完全病毒[10,11]，对随后的感染及病毒复制产生影响。本实验结果表明，病毒感染72h,MOI=10-1及10-2的HA血凝滴度相近，但接种病毒量相差10倍，高MOI对于生物反应器中的病毒培养及细胞流感疫苗的生产会增加前期病毒液制备工作的繁琐和成本，因此选择10-2为最适MOI。

流感病毒的非裂解型血凝素前体HA0被细胞蛋白酶水解后才能变为具有感染性的血凝素HA1和HA2[12]，继而与细胞表面的唾液酸结合进行感染[13]。而病毒维持液中无细胞蛋白酶，因此需加入适量胰酶。若胰酶浓度过低，则血凝素水解不彻底，病毒感染效力差；若浓度过高，则会导致MDCK细胞结团、死亡。本实验结果表明，当胰酶浓度>10μg/mL时，病毒HA血凝滴度反而降低，表明大于该浓度的胰酶对细胞有一定影响，从而抑制了病毒的复制。因此确定最适胰酶终浓度为10μg/mL。

一般来说，MOI相同时，细胞接毒密度越高则病毒产量越大，过高的细胞密度反而使病毒产量降低，该现象称为“细胞密度效应”[14]。此现象是由于过多的细胞消耗了病毒维持液中的大部分营养物，积累了过多的代谢副产物，因此影响了病毒持续感染细胞并复制增殖。对于贴壁细胞及生物反应器中的培养，可通过换液、流加等方法减轻或消除这些影响。本实验结果表明，当细胞接毒密度为（50～100）×104个/mL时，病毒产量较低，表明该范围内细胞密度过低，病毒维持液中的营养物可为更高密度细胞提供所需营养物质；当细胞接毒密度为（300～500）×104个/mL，病毒HA血凝滴度降低，表明此时已出现“细胞密度效应”；细胞接毒密度为700×104个/mL时病毒HA血凝滴度较低，与100×104个/mL时接近，此时的“细胞密度效应”十分明显。因此最终选择300×104个/mL为最适细胞接毒密度。

病毒收获的时间对病毒的产量及活力也有较大影响。若收获时间过早，病毒还未完全感染细胞，或已感染的细胞病变不完全，使病毒产量低；若收获时间过晚，病毒被释放至维持液中的时间较长，将受到病毒维持液中某些代谢废物影响而造成病毒活力下降。本实验结果表明，感染0～72h的病毒HA血凝滴度逐渐升高，72h达最高，随后稍有下降，因此选择72h为最适病毒收获时间。

本研究优化了乙型流感病毒在悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件，最适培养条件为：MOI=10-2，胰酶终浓度为10μg/mL，细胞密度为300×104个/mL，收获时间为72h。采用最佳条件在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖乙型流感病毒，可显著提高流感病毒的HA血凝滴度及病毒滴度（CCID50）。本实验为后续采用生物反应器扩大培养流感病毒及其他型别毒株培养条件的研究奠定了基础。

参考文献：

[4]谢辛慈,刘璐,袁松华,等.广谱流感疫苗的研究进展[J].微生物与感染,2016,11(1):48-54.

[8]贾佳,赵永祥.提高H9N2亚型禽流感病毒的拯救效率条件的优化[J].生物技术世界,2016,14(4):134.

[12]慕毓.流感病毒细胞培养时胰酶添加量的优化分析[J].中国城乡企业卫生,2016,6:63-64.

[13]吕让,王丹,宋彩玲,等.稳定表达跨膜丝蛋白酶2基因的MDCK细胞系的建立[J].中国预防兽医学报,2014,36(9):704-707.

王笑天,李爽,席莉,丁瑞远,刘玮彤,姚为民,柴文,张雪梅,吴业红.乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化[J].中国生物制品学杂志,2020,33(05):544-548.