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肝癌患者循环肿瘤细胞PD-L1表达及其临床意义

2020-05-25 396 上传者：管理员

摘要：目的：探讨原发性肝癌（肝癌）患者外周血循环肿瘤细胞（CTC）的程序性死亡-配体1(PD-L1）表达及其与肝癌患者临床病理特征的关系。方法：回顾性分析2017年1月至2019年12月中山大学孙逸仙纪念医院收治的30例肝癌患者临床资料。患者均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。其中男27例，女3例；年龄29～77岁，中位年龄51岁。多重RNA原位分析检测患者外周血中CTC分型及其PD-L1表达水平，分析PD-L1表达与临床病理特征之间的相关性。相关性分析采用χ2检验或Fisher确切概率法。结果：共检出CTC275个，其中上皮型82个，间质型51个，混合型142个。混合型PD-L1平均表达水平为0.89，明显高于上皮型的0.55及间质型的0.49。混合型CTC为主型肝癌患者数量及PD-L1表达水平亦明显高于其他分型患者。PD-L1阳性的CTC分型与患者肝硬化及肝被膜侵犯相关（x2=9.707,7.153;P<0.05）。肝癌患者平均PD-L1表达水平仅与患者饮酒史相关（P=0.042）。结论：肝癌患者CTC以混合型为主，其PD-L1表达水平高于其他分型患者。PD-L1阳性的CTC分型与肝硬化及肝被膜侵犯相关，而PD-L1表达水平仅与患者饮酒史相关。

关键词：
循环
癌
程序性死亡-配体1
肝细胞
肿瘤细胞
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原发性肝癌（肝癌）是目前全球第二大癌症死亡原因，以肝细胞癌为主[1]。肝癌的治疗方式主要包括手术切除或肝移植、射频消融电化学治疗、栓塞治疗以及以索拉非尼为代表的全身治疗，尽管治疗手段多样，但肝癌患者预后仍较差，尤其是中晚期肝癌5年生存率仅为10～20个月[2]。近年来，以抗程序性死亡受体-1和程序性死亡-配体1为代表的免疫治疗发展迅速。既往研究发现PD-L1是PD-1的主要配体，生理条件下，PD-1/PD-L1之间的相互作用可以避免免疫细胞过度活动，而多种恶性肿瘤细胞过表达PD-L1实现免疫逃逸[3]。在非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌中PD-L1表达均有上调[4,5]。

通过非侵入性血液取样来研究非血液性癌是目前癌症诊断学的前沿热点之一，在指导癌症治疗及实时无创监测方面有重要意义，其研究主要包括分析血液中的游离DNA及完整癌细胞[6]。外周血循环肿瘤细胞来源尚未完全明确，主流的观点认为是通过上皮-间质转化过程主动侵入血管[7]。本研究检测外周血中CTC分型、数量及其PD-L1表达水平，分析不同分型的CTC中PD-L1表达及其与肝癌患者临床病理特征之间的相关性，为PD-L1免疫治疗疗效监测等提供依据。

资料与方法

一、一般资料

回顾性分析2017年1月至2019年12月中山大学孙逸仙纪念医院胆胰外科收治的30例肝癌患者临床资料。其中男27例，女3例；年龄29～77岁，中位年龄51岁。所有患者均签署由医院伦理委员会批准的患者知情同意书，符合医学伦理学规定。纳入标准：年龄18～80岁，性别不限；术前经超声、CT、MRI诊断及术后病理确诊的肝癌病例；所有病例均有完整的临床病理资料，术前均未接受任何放疗、化疗及免疫治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤的患者；术前采集外周血量不足或质检不合格等可能影响检测结果准确性等情况；术前进行过放疗、化疗及免疫治疗的患者。

二、方法

1.样品采集：

术前1d留取患者外周血，8号采血针静脉采集外周血5ml于EDTA抗凝采血管内。

2.多重RNA原位分析检测CTC分型及其PD-L1表达：

离心、裂解红细胞，1100×g离心5min去上清后，固定、裂解红细胞。纳米技术过滤，富集CTC，将处理过的样本通过8μm孔径滤过膜过滤，富集CTC。特异性捕获探针和预扩增探针进行多重RNA原位分析及信号放大，荧光染料染色。

3.结果判定：

利用自动识别系统阅读荧光信号，判定检测结果。根据不同荧光将CTC分为上皮细胞型、间质细胞型、混合细胞型（图1）。根据每个CTC的PD-L1表达水平进行评分，定义CTC细胞中PD-L1无表达的评分为0,PD-L1低表达、中表达、高表达分别评分为1、2、3，然后计算患者5ml血液检出的所有CTC的PD-L1平均表达水平。其计算方法为：外周血CTC的PD-L1平均表达水平=（PD-L1无表达CTC个数×0+PD-L1低表达CTC个数×1+PD-L1中表达CTC个数×2+PD-L1高表达CTC个数×3）/外周血中检出的CTC总个数。

图1CTC不同上皮细胞表型标志物及PD-L1表达

4.观察指标：

观察CTC数量、分型及PD-L1表达水平。分析PD-L1阳性CTC不同分型与肝癌患者临床病理特征的相关性。根据PD-L1平均表达水平将患者分为PD-L1高表达组及低表达组，分析PD-L1高表达患者与临床病理特征相关性。

三、统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。PD-L1阳性的CTC分型与肝癌患者临床病理特征的相关性分析采用χ2检验。PD-L1高表达患者与临床病理特征相关性分析采用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、CTC计数、分子分型及其PD-L1表达水平

30例肝癌患者外周血中均检测到CTC，数量1～25个/5ml不等，中位数7个。本组患者共检出CTC275个，其中上皮型CTC82个，间质型51个，混合型142个。肝癌患者CTC以混合型为主，且混合型CTC的PD-L1表达水平也明显高于上皮型及间质型CTC（表1）。根据患者检出的CTC主要分型的不同，以>50%为标准将患者分为上皮型CTC为主型、混合型CTC为主型、间质型CTC为主型及均匀分布型4种类型，发现以混合型CTC为主型的肝癌患者居多，且这类患者CTC的PD-L1平均表达水平也明显高于其他类型患者（表1）。

表1肝癌患者外周血CTC分型及其PD-L1表达水平

二、PD-L1阳性的CTC分型与肝癌患者临床病理特征的相关性

30例肝癌患者中PD-L1表达阳性的CTC总数149个，其中上皮型37个，间质型20个，混合型92个。PD-L1阳性CTC分型与肝癌患者肝硬化（χ2=9.707,P=0.008）及肝被膜侵犯（χ2=7.153,P=0.028）相关，与其他临床病理特征均无关（P>0.05，表2）。

表2PD-L1阳性CTC不同分子表型与肝癌患者临床病理特征的相关性（个）

三、PD-L1高表达与肝癌患者临床病理特征的相关性

结果显示，PD-L1平均表达水平中位数为0.607，以此将患者分为PD-L1高表达组及低表达组后进行分析，结果发现肝癌患者平均PD-L1表达水平仅与患者饮酒史相关（P=0.042），有饮酒史的患者平均PD-L1高表达率明显高于无饮酒患者，与其他临床病理特征均无关（P>0.05，表3）。

表3外周血CTC中PD-L1高表达与肝癌患者临床病理特征的相关性（例）

讨论

肿瘤转移是一个复杂、多阶段的过程，转移性的肿瘤细胞须从原发肿瘤脱落、侵入血管、于血液中存活、离开血流、游离组织定植，在这过程中，CTC是重要的中间阶段，被认为是肝癌术后复发转移的主要根源[8,9]。因此CTC用于临床肿瘤的早期诊断、预后、治疗及监测等方面有着广泛的应用前景。CTC在外周血的存在极少，平均每106～107个细胞才有一个，因此，对于CTC的富集、检测非常困难[10]。本次研究采用的CanPatrol®CTC分型检测技术是益善生物开发的CTC检测二代技术，并整合了纳米技术及MRIA技术，同步实现了CTC的分离、分型及检测。

EMT是肿瘤细胞在内外因素的严格调控作用下，从上皮样表型向间质表型转变的过程[11]。研究表明，出现化疗耐药或放疗耐受的患者通常会有更多数量的CTC发生EMT[12,13]。同时，癌症治疗也会影响CTC的表型，难治性患者常会有更多的间质型CTC，而对治疗有反应的患者通常会有更多的上皮型CTC[14,15]。本次研究结果显示在30例肝癌患者中检出的外周血CTC数量范围为1～25个/5ml不等。根据EMT标志物的表达不同，对CTC进行精准分型，结果显示检出的CTC以混合型为主,占52%，明显高于上皮型30%及间质型18%。根据检出的CTC主要分型的不同，发现以混合型CTC为主型的肝癌患者居多，提示发生EMT的CTC可能有利于其在血液中的存活及侵袭转移的发生，这与Bednarz-Knoll等[16]证实的CTC迁移过程中EMT导致了肿瘤侵袭转移一致。

免疫治疗是肿瘤治疗领域研究的热点，其中以PD1/PD-L1研究最为深入。PD-1主要表达于活化T细胞上，静息状态下T细胞PD-1低表达，PD-1激活后可限制T细胞活化、增殖，促进免疫耐受。PD-L1是PD-1的主要配体，在肿瘤细胞上高表达的PD-L1起到诱导T细胞失活、凋亡，保护表达PD-L1的肿瘤细胞免受CD8+T细胞杀伤而出现免疫逃逸。因此，肿瘤细胞PD-L1高表达常被认为是一个不良预后的因素，同时也是临床选择靶向PD-1/PD-L1药物治疗的指标之一[17]。研究表明，靶向PD-1/PD-L1的药物Nivolumab在晚期肝癌患者中具有显著的抗肿瘤作用[18]。然而，抗PD-1/PD-L1的治疗在很多上皮型肿瘤中均表现不佳，说明我们对肿瘤免疫耐受背后的机制了解还远远不够[17]。临床研究发现，在转移性化疗耐药的非小细胞肺癌患者中，抗PD-1Nivolumab治疗6个月后，血液中PD-L1阳性的CTC持续存在提示肿瘤免疫治疗耐受[19]。Cao等[20]研究发现PD-L1可促进肿瘤细胞EMT发生，肺腺癌中包括PD-L1在内的多个免疫检查点表达增高的肿瘤细胞多表现为EMT表型[21,22,23]，说明肿瘤细胞EMT、PD-L1及肿瘤免疫耐受等方面有着广泛的内在联系，而目前关于这部分的研究尚不清楚，且研究主要集中在肿瘤组织中。而作为肿瘤复发、转移重要因素之一的CTC在这方面研究却极少。因此我们利用CanPatrol技术及MRIA技术，检测不同类型CTC上PD-L1的表达水平，发现混合型CTC的PD-L1平均表达水平明显高于上皮型及间质型CTC，且以混合型CTC为主型的肝癌患者PD-L1平均表达水平也显著高于其他类型患者，说明CTCPD-L1可能在混合型CTC的形成、存活及EMT过程发挥重要作用,这也为Cao等[20]在动物模型上证实的PD-L1促进肿瘤细胞EMT发生提供了临床证据。进一步分析数据，根据PD-L1表达的高低分为PD-L1无表达、低表达、中表达及高表达，CTC上PD-L1无表达为PD-L1阴性CTC,CTC上PD-L1低表达、中表达、高表达为PD-L1阳性CTC。由于CTC表达PD-L1可能作为其潜在免疫逃逸机制和抗PD-L1治疗靶点，因此我们重点关注的是PD-L1阳性的CTC。对不同年龄、饮酒史、乙肝病史等临床病理特征的肝癌患者进行PD-L1阳性的3类CTC计数进行比较，结果显示，PD-L1阳性CTC的上皮-间质表型与肝硬化及肝被膜侵犯有关。同时我们还发肝癌患者CTC平均PD-L1表达水平仅与患者饮酒史相关（P=0.042），有饮酒史的患者血液中CTC的平均PD-L1高表达率明显高于无饮酒患者，我们在既往研究中未曾有类似的报道。

综上所述，肝癌患者CTC以混合型为主，混合型PD-L1表达水平高于其他分型患者。PD-L1阳性CTC分子分型与肝硬化及肝被膜侵犯相关，而PD-L1表达水平仅与患者饮酒史相关。本研究期待进一步完善，将来需要纳入更多的肝癌样本以及对血液中CTC动态变化的结果和抗PD-L1免疫治疗后的疗效等监测，以便进一步验证本次试验结果及提供更好的临床治疗建议。

林俊龙,黄贻培,罗伟鑫,许磊波,刘超.肝癌患者循环肿瘤细胞PD-L1表达及其临床意义[J].中华肝脏外科手术学电子杂志,2020,9(03):254-259.