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免疫染色法检测杆状病毒滴度方法建立和优化

2024-01-22 66 上传者：管理员

摘要：目的建立并优化杆状病毒滴度的检测方法。方法按照免疫染色法建立杆状病毒滴度检测方法，并对该方法的适用参数进行优化，通过筛选细胞接种浓度、病毒接种浓度、最适抗体稀释倍数，选择最佳反应条件优化检测方法，通过重复性、适用性实验验证该方法的准确性和特异性。结果细胞接种浓度选择0.65×106个/ml、病毒接种浓度选择104、抗体稀释倍数选择1∶500时检测结果最佳，应用最适检测参数进行重复验证，检测不同样品，仅杆状病毒组出现特异性病毒噬斑。结论建立并优化了重组杆状病毒滴度免疫染色方法，该方法具有良好的重复性、特异性和准确性，可用于生产中病毒滴度的检测。

关键词：
免疫染色法
杆状病毒
滴度检测
苜蓿夜蛾
重组蛋白
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杆状病毒表达载体系统是一个以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的表达系统[1]。杆状病毒有苜蓿夜蛾核型多角体病毒、家蚕核多角体病毒、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒等[2]。在应用杆状病毒表达载体系统时病毒的扩增和重组蛋白的表达尤为关键，而这取决于杆状病毒与细胞的合适比例即感染复数(MOI)[3]。为了达到合适的MOI值，精确测定杆状病毒滴度非常必要。

目前测定杆状病毒滴度的方法有很多种，主要有噬斑法、终点稀释法、免疫染色法、流式细胞术法、荧光定量PCR法及比色指示剂测定法等[4]。这些方法大多存在不足，如终点稀释法耗时较长，一般需要5～7 d,且对操作者的经验要求较高；流式细胞术法需要的仪器设备较为昂贵，不具备普遍操作性[5];免疫染色法用时较短，能快速测定病毒滴度，工作原理：鼠抗GP64作为一抗，HRP标记羊抗鼠作为二抗进行抗原—抗体结合反应显色，然后观察斑点、计算病毒滴度，但市售杆状病毒滴度快速检测试剂盒价格昂贵、且有效期短[6,7]。鉴于此，本研究以戊型肝炎病毒(HEV)为基础，建立针对杆状病毒滴度的免疫检测方法，并以细胞接种浓度、病毒接种浓度、抗体稀释倍数等参数对该方法进行优化，通过重复性、适用性实验验证该方法的准确性和特异性。

1、材料与方法

1.1细胞与病毒

Sf9细胞购自美国典型培养物保藏中心，由国药中生生物技术研究院有限公司戊肝课题组(以下简称本科室)传代保存；HEV重组杆状病毒、HEV蛋白抗原、新型冠状病毒S蛋白抗原、新型冠状病毒M蛋白重组杆状病毒由本科室提供。

1.2试剂与仪器

酸水解酪蛋白购自北京欣惠泽奥科技有限公司，小鼠抗GP64购自美国eBioscience公司，HRP标记羊抗鼠IgG购自美国Abcam公司，SFX-Insect培养基购自美国HyClone公司，TMB显色液购自美国Thermo公司，甲醛—丙酮固定液由本科室自制。96孔培养板购自美国Corning公司，酶联免疫斑点分析仪购自美国C.T.L公司，生物安全柜购自美国Thermo公司，恒温培养箱购自上海一恒公司。

1.3检测方法的建立

调整Sf9细胞浓度，加入到96孔培养板，100μl/孔，静置1 h[8,9]。稀释病毒，将HEV重组杆状病毒进行10倍系列稀释至10、102、103、104、105、106,加入96孔培养板，50μl/孔，培养2 h,吸去病毒加入1.5%甲基纤维素，培养3 d。去掉上层覆盖液，加入丙酮—甲醛固定液，100μl/孔，室温放置30 min。用PBST洗液洗3遍：200μl/孔。加入2%酪蛋白封闭液，50μl/孔，常温放置10 min。加入用2%酪蛋白封闭液稀释好的一抗GP64,50μl/孔，置于37℃孵育30 min。用洗液洗3遍。加入用2%酪蛋白封闭液稀释好的二抗羊抗鼠IgG,50μl/孔，置于37℃孵育30 min。用洗液洗3遍。加入50μl/孔TMB显色液，避光放置30 min。用酶联免疫斑点分析仪计数蓝色斑点数。

1.4检测方法优化

1.4.1细胞接种浓度筛选：

将Sf9细胞复苏后进行传代悬浮培养，实验结果活率达到95%以上。选择0.5×106、0.65×106、1.0×106、2.0×106个/ml 4个细胞浓度进行接种，做复孔，100μl/孔。2 h时接种重组HEV杆状病毒进行培养，于2 h、4 h、2 d、3 d在显微镜下拍照，并于第3天进行病毒滴度检测，确定最适细胞接种浓度。

1.4.2病毒接种浓度筛选：

将用摇瓶培养第4天的HEV重组杆状病毒，及用wave生物反应器进行表达的第4天的HEV重组杆状病毒，进行10、102、103、104、105、106系列稀释，接种于铺好的0.65×106个/ml细胞板上，放置2 h,按照滴度检测方法检测病毒滴度，确定最适病毒接种浓度及MOI值。

1.4.3固定前吸去病毒对结果的影响：

将用摇瓶培养第4天的HEV重组杆状病毒，及用wave生物反应器进行表达的第4天HEV重组杆状病毒，接种于铺好的0.65×106个/ml细胞板上，加覆盖液(甲基纤维素)前是否吸去病毒进行2组实验，按照检测方法检测病毒滴度求平均值，确定是否吸去病毒液。

1.4.4最适抗体稀释倍数选择：

将HEV重组杆状病毒，接种于铺好的0.65×106个/ml细胞板上，培养3 d,去掉上层覆盖液，加入丙酮—甲醛固定液，100μl/孔，室温放置30 min。用PBST洗液洗3遍：200μl/孔。加入2%酪蛋白封闭液，50μl/孔，常温放置10 min。加入用2%酪蛋白封闭液稀释好的GP64一抗和HRP羊抗鼠IgG二抗，选择1∶250、1∶500、1∶750、1∶1 000共4个稀释倍数进行实验。检测病毒滴度，确定最适合的抗体稀释倍数。

1.5重复性实验

选取3个批次的生物反应器表达的HEV杆状病毒1～6 d样品，按优化选择的参数进行3次实验检测病毒滴度。

1.6特异性实验

对本科室在研的表达新型冠状病毒M蛋白重组杆状病毒(1～4 d的病毒)进行2组实验检测。由于重组杆状病毒中携带有外源的重组基因片段，其表达产物存在潜在的非特异性干扰，因此将纯化的重组抗原蛋白直接用优化验证的实验方法进行检测；同时设立添加病毒稀释液的阴性及病毒液的阳性对照组实验，检验系统本身的非特异性，观察新型冠状病毒重组杆状病毒检测方法的适用性。实验样品如下：纯化的重组抗原蛋白HEV蛋白、新型冠状病毒S蛋白、阴性对照(稀释液，SFX培养基)、阳性对照(HEV杆状病毒、M蛋白重组杆状病毒)。

2、结果

2.1细胞接种浓度筛选

通过监测Sf 9细胞生长情况发现，不同细胞密度培养3 d后观察生长状况。0.65×106个/ml浓度组培养至第3天时完全覆盖96孔培养板板底；0.5×106个/ml浓度组细胞培养稀疏，未能完全覆盖96孔培养板板底；1.0×106个/ml和2.0×106个/ml浓度组细胞过于密集，呈现叠加。因此，选择0.65×106个/ml为最佳，该浓度条件下，完全覆盖96孔培养板板底，适用于噬斑形成。不同的细胞浓度的滴度结果，见表1。

表1不同细胞接种浓度的滴度结果比较(PFU/ml)

2.2病毒接种浓度筛选

为验证该检测方法适用的广泛性，同时选用摇瓶培养和wave培养两种方式进行验证。两种培养方式实验结果均显示，病毒在10、102、103倍稀释接种后，病毒噬斑过于密集，超过100个/孔，不利于计数；而在104稀释时斑点为0～50个/孔，满足实验结果要求，因此选择病毒稀释倍数104为最佳接种浓度。具体实验结果见表2。

表2不同病毒稀释度的滴度结果比较(PFU/ml)

2.3固定前是否吸去病毒结果比较

结果表明，吸去病毒实验组的噬斑清晰均一性好，见表3。

表3固定前是否吸去病毒的滴度结果比较(PFU/ml)

2.4最适抗体稀释倍数选择

对一抗和二抗分别进行1∶250、1∶500、1∶750、1∶1 000倍稀释，得到病毒滴度分别为1.92×105、1.72×105、1.6×105、1.08×105PFU/ml。对实验结果进行分析可知，GP64一抗和HRP羊抗鼠IgG二抗的稀释度为1∶250和1∶500倍稀释组的噬斑清晰，1∶750和1∶1 000倍稀释组的斑点不是很清楚，由于1∶250倍稀释和1∶500倍稀释的结果均好，为了节省抗体的使用量，因此抗体稀释度选择1∶500倍稀释。

2.5重复性实验

用wave生物反应器进行3批中试级别的HEV杆状病毒的培养，每批均对1～6 d的培养液进行滴度检测，病毒滴度逐天增高在第4天达到最高值，后逐天降低，3批有相同的变化趋势。并对3个HEV重组杆状病毒进行3次重复性实验，计算病毒滴度，结果见表4。

表4 3次重复性实验对数值结果及分析

2.6特异性实验

2.6.1新型冠状病毒M蛋白重组杆状检测：

对本科室在研表达重组新型冠状病毒M蛋白重组杆状病毒(1～4 d的病毒)进行检测，得到1～4 d的新冠病毒的滴度检测结果分别为4.48×107、6.10×107、7.34×107、7.98×107 PFU/ml,阴性对照SFX培养基为0 PFU/ml。经分析可得，检测结果噬斑清晰，滴度值达到预期值，可用于滴度检测。

2.6.2重组杆状病毒对该方法特异性：

纯化的重组抗原蛋白HEV蛋白、新型冠状病毒S蛋白抗原、HEV杆状病毒、新型冠状病毒M蛋白重组杆状病毒、阴性对照的病毒滴度结果分别为0、0、2.40×106、1.66×106、0 PFU/ml。经分析可知，阳性对照HEV杆状病毒和新型冠状病毒M蛋白重组杆状病毒均检出病毒滴度，阴性对照未检出病毒滴度，HEV蛋白抗原无斑点，表明无杆状病毒，新型冠状病毒S蛋白抗原无杆状病毒污染，实验达到预期效果。上述结果表明系统本身及杆状病毒表达的抗原不存在非特异性干扰问题。

3、讨论

本研究对病毒滴度的检测方法进一步优化，通过优化实验确定最佳的细胞接种浓度、病毒的接种浓度、抗体的稀释浓度等参数。本实验确立0.65×106个/ml细胞为最佳接种浓度。杆状病毒的稀释度为104的斑点数在0～50个，易于计数，因此选择104作为病毒稀释度。GP64一抗和羊抗鼠IgG二抗的稀释倍数选择1∶500斑点结果清晰。另外加甲基纤维素覆盖液前应吸去病毒液。按照上述方法优化后的免疫染色法显示蓝斑清晰可见，易于在显微镜下计数。对wave生物反应器培养的HEV杆状病毒进行3次滴度检测，结果显示滴度达到1×106 PFU/ml以上，说明此方法具有良好的稳定性。且选择摇瓶和wave生物反应器两种培养方式，结果均理想。另外针对本科室构建的重组杆状新型冠状病毒进行检测，结果显示也在1×106 PFU/ml以上。对此方法进行的特异性实验，结果表明此方法有较好的适用性。

综上所述，本文建立了一种高效检测杆状病毒的方法并进行了优化，此方法准确率高，且经济实用，耗时较短，一般3 d可测出结果，具有灵敏度高、特异性强及重复性好等优点，可用于生产过程中各个环节的杆状病毒滴度的检测，为疫苗生产的质量控制奠定良好基础。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。

参考文献:

[1]黄仕和,余模松.测定杆状病毒滴度方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2007,35(2):79- 83.

[2]孙阳,张淑颖.昆虫杆状病毒表达系统的研究及其新进展[J].江西农业学报,2006,18(5):96-99.

[3]刘高强,章克昌,王晓玲,等.昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展[J].中国生物工程杂志,2004,24(7):40- 44.

[4]凌同.昆虫杆状病毒表达系统的研究进展与应用[J].微生物学免疫学进展,2014,42(2):70-78.

[5]荣芮,李婷婷,张玉云,等.昆虫杆状病毒表达载体系统在疫苗研究中的应用进展[J].生物工程学报,2019,35(4):577-588.

[6]陈璟,方宏清,周长林,等.昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化[J].中国生物工程杂志,2004,24(3):1- 6.

[7]张占东,李媛媛,吴清胜,等.免疫荧光法检测杆状病毒滴度的建立及验证[J].中华微生物学和免疫学杂志,2018,38(9):702-709.

[8]武汉中博生物股份有限公司.一种测定杆状病毒滴度的方法:

[9]吴清胜,李静,张占东,等.Sf9细胞的高效扩增及类病毒颗粒高效自组装的培养工艺[J].中国生物制品学杂志,2017,30(12):1311-1316,1320.