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耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌5种耐药基因检测

2024-01-22 138 上传者：管理员

摘要：目的研究耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的流行与耐药机制，为医院治疗和预防鲍曼不动杆菌提供依据。方法本研究共收集海南医学院第二附属医院住院患者临床分离的243株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌，所有菌株按照统一的操作规程进行药敏试验，采用PCR检测碳青霉烯类耐药基因。结果 243株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌中，主要来自ICU 68株(27.98%),痰液标本149株(61.32%);9种常用抗菌药物的耐药率>90%,其中替卡西林/棒酸耐药率最高为100.00%,多黏菌素B未出现耐药情况；5种耐药基因检出率分别为blaOXA23(88.07%)、blaOXA51(88.07%)、blaNDM(23.05%)、blaOXA58(11.93%)及blaOXA24(2.88%)。结论对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药情况监控有助于医院加强抗菌药物的使用和管理，防止产生耐药菌株的产生与蔓延。

关键词：
PCR
患者感染
耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌
耐药基因
药敏试验
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鲍曼不动杆菌(AB)是一种需氧革兰阴性菌，它具有较强的生存能力及产生和传播其耐药性的能力[1]。目前AB也成为医院患者感染的重要条件致病菌之一[2]。近年来，随着耐碳青霉烯类抗菌药物在临床上被广泛使用，使得耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)的耐药性也在不断上升。CRAB在院内甚至地区之间均存在散播情况，不仅威胁社会公共健康，还给医院感染预防控制带来挑战。为了解临床分离AB的耐药现状，现分析CRAB的分布及耐药情况，检测碳青霉烯类抗生素耐药基因，为治疗和预防AB提供依据。

1、材料与方法

1.1菌株来源

收集2018年11月23日—2019年12月4日海南医学院第二附属医院住院患者临床分离的CRAB 243株，剔除同一患者重复菌株。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923均购于卫生部临检中心。

1.2仪器与试剂

Vitek-2 Compact型全自动微生物分析仪及配套鉴定卡、PCR扩增仪(Biometra公司，Tgradient96,德国)、电泳仪(Bio-Rad公司，美国)、低温高速离心机(Beckman,美国)、二氧化碳培养箱(1815-TC型，SHEL-LAB,美国)、干式恒温仪、显微凝胶数码图像分析系统Tanon-1600购于上海天能科技有限公司、琼脂糖(Biowest)、2xTaq MasterMix、DNA Marker(100bp Plus)购于北京天根生化科技、GoldViewⅠ型核酸染料购于北京索莱宝科技有限公司、LB琼脂培养基。

1.3耐药基因检测

1.3.1 DNA的提取：

采用“一步法”直接提取DNA模板，将菌株在LB琼脂培养基上划线接种分离培养，培养箱37℃培养24 h后，用200μl灭菌枪头在平板上刮取适量菌落，置于装有200μl无菌水的离心管中充分混匀；然后将离心管置于95℃加热灭活10 min, 4 000 r/min离心5 min,最后将上清液吸取至新的离心管中并弃去沉淀，作为DNA模板，放-20℃冰箱中保存待检。

1.3.2 PCR扩增：

通过PCR扩增基因序列的方法对所收集的菌株检测碳青霉烯类耐药基因。PCR反应体系：MasterMix25μl、上游引物2μl、下游引物2μl、DNA模板2μl、无菌水19μl,总体积50μl。PCR反应程序：95℃预变性5 min、95℃变性30 s、根据各个引物选择对应的退火温度退火40 s(blaOXA23、blaNDM、blaOXA58为56℃,blaOXA51、blaOXA24为52℃)、72℃延伸40 s,共30个循环，72℃终延伸5 min。扩增后得到的产物经2%琼脂糖凝胶，230 V电泳15 min,放入显微凝胶数码图像分析系统进行分析。

1.4细菌鉴定与药敏试验

菌株分离按《全国临床检验操作规程》第3版进行，采用Vitek-2 Compact全自动微生物分析仪及配套鉴定卡行菌株鉴定和药敏实验，本研究按美国临床和实验室标准研究所抗菌药物敏感性检测操作标准方法CLSI 2021判读结果。

2、结果

2.1标本分布

243株CRAB的科室分布主要来自ICU,共68株(27.98%),其次为神经内科、呼吸内科，分别为36株(14.81%)、28株(11.52%),其他分布在不同的科室。标本主要来源是呼吸道标本，痰液标本149株(61.32%)、肺泡及肺泡灌洗液30株(12.35%)、伤口及伤口分泌物27株(11.11%),其他标本还包括少量尿液、血液、引流液等。详细情况见表1、2。

表1 243株CRAB临床科室分布构成

表2 243株CRAB标本类型分布构成

2.2药敏结果

243株CRAB的药敏试验结果显示耐药情况较严重，对9种常用抗菌药物的耐药率均>90%,对替卡西林/棒酸的耐药率最高达到100.00%,多黏菌素B未检测到耐药情况，见表3。

2.3耐药基因检测结果

243株CRAB检出携带blaOXA23基因214株(88.07%),携带blaOXA51基因214株(88.07%),携带blaNDM基因56株(23.05%),携带blaOXA58基因29株(11.93%),携带blaOXA24基因7株(2.88%)。部分blaOXA23基因、blaOXA51基因的电泳图见图1、2。

表3 243株CRAB对15种抗菌药物的药敏情况(%)

图1部分blaOXA23基因PCR扩增图

3、讨论

AB已经成为逃避抗菌药物作用最严重的六大超级细菌之一[3]。研究表明，目前AB是仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的革兰阴性病原菌[4]。随着广谱抗菌药物的大量使用特别是碳青霉烯类抗生素的广泛使用，CRAB感染呈逐年增加趋势，给临床治疗带来较大困难[5]。CRAB的耐药性已成为全球性医疗行业问题，这些菌株引起的感染导致了住院患者的病死率高和治疗成本高[6,7]。2018年与2019年全国细菌耐药监测报告显示，CRAB的检出率仍维持在较高水平[8,9]。

图2部分blaOXA51基因PCR扩增图

本研究收集医院分离的住院患者CRAB 243株，分布前3位的科室是ICU(27.98%)、神经内科(14.81%)、呼吸内科(11.52%),其主要原因是ICU患者免疫功能低下、病情危重和侵入性措施多、ICU相比其他科室使用呼吸机的频率高。标本来源以呼吸道标本为主，痰液(61.32%)、肺泡及肺泡灌洗液(12.35%),这与医院住院患者进行部分侵入性操作时，如机械通气会破坏人体上呼吸道的天然防护屏障有关，因此导致呼吸道防御功能下降，易受感染。

本研究药敏结果提示，243株CRAB对替卡西林/棒酸的耐药率最高为100.00%;对碳青霉烯类、头孢菌素类药物的耐药率>98%;对复方抑制类药物如氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及喹诺酮类药物的耐药率>95%。此外，多黏菌素B未检测到耐药情况，敏感率为100.00%。提示医院在治疗CRAB感染方面，谨慎使用替卡西林/棒酸作为经验性治疗的首选药物，可考虑采用多黏菌素B,但应注意用抗菌药物合理性，避免耐药情况加剧。

CRAB耐药机制有多种：产生碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失或表达降低、主动外排系统过度表达、青霉素结合蛋白位点改变及整合子机制等[10]。耐药机制中以产碳青霉烯酶为主，主要为B和D类碳青霉烯酶[11,12]。B类酶包括有NDM、IMP和VIM等型；根据氨基酸同源性，D类酶可分为8种，在AB中报道的主要是OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58[13]。为了明确目前在本院主要流行的碳青霉烯类耐药基因，本研究主要检测了5种常见碳青霉烯类耐药基因，结果显示blaOXA23(88.07%)、blaOXA51(88.07%)、blaNDM(23.05%)、blaOXA58(11.93%)及blaOXA24(2.88%)。表明携带blaOXA23基因和携带blaOXA51基因是医院碳青霉烯耐药的主要原因，主要为B类碳青霉烯酶，与相关报道一致[14,15]。值得注意的是，虽然B类碳青霉烯酶不是医院碳青霉烯酶耐药的主要原因，但本研究中检出的56株AB携带blaNDM基因的同时37株也携带blaOXA23基因，该结果提示在后续的临床感染的治疗中应注意两种耐药基因间的相互散播。

综上所述，携带blaOXA23基因和携带blaOXA51基因是医院碳青霉烯耐药的主要原因。医院应采取更有效的措施来防止发生感染，包括隔离感染患者和彻底消毒周围环境，加强医疗工作的消毒护理，做好手部卫生，防止交叉感染等。另外，应严格管理和控制抗菌药物的使用，防止产生耐药菌株的产生与蔓延。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。

参考文献:

[2]高崴崴,刘颖,刘待见,等.2012-2014年住院患者鲍曼不动杆菌耐药性变迁及耐药基因检测[J].中国病原生物学杂志,2017,12(12):1206-1210.

[5]饶丽华,涂建斌,王艳琴.鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶耐药基因分析及同源性研究[J].中国当代医药,2017,24(6):115-117,131.

[7]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2016年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2017,17(5):481- 491.

[8]国家卫生计生委合理用药专家委员会,全国细菌耐药监测网.2018年全国细菌耐药监测报告[J].中国合理用药探索,2020,17(1):1-10.

[9]国家卫生健康委合理用药专家委员会,全国细菌耐药监测网.2019年全国细菌耐药监测报告[J].中国合理用药探索,2021,18(3):1-11.

[10]闫玲,顾兵,张丽,等.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药机制[J].实用医学杂志,2018,34(15):2594-2599.

[13]贺毅.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐酶机制及临床治疗的研究进展及其对策[J].抗感染药学,2017,14(4):725-729.DOI:10.13493/j.issn.1672-7878.2017.04- 002.

[14]宁长秀,卢雪兰,邹文娇,等.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌中碳青霉烯酶基因的检测[J].中国抗生素杂志,2018,43(7):901- 904.DOI:10.3969/j.issn.1001- 8689.2018.07.021.

[15]刘建华,李锐,钱树坤,等.86株鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶耐药基因分析及同源性研究[J].国际检验医学杂志,2021,42(3):301-304.DOI:10.3969/j.issn.1673- 4130.2021.03.011.