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调控因子Fis对肺炎克雷伯菌致病力影响与机制研究

2024-04-12 10 上传者：管理员

摘要：目的探究调控因子Fis对肺炎克雷伯菌毒力及致病相关因子的影响。方法构建肺炎克雷伯菌fis基因缺失突变株及回补株，通过体外实验分析肺炎克雷伯菌野生株(WT),fis基因敲除株(Δfis)及回补株(C-fis)的生长能力及生物被膜、荚膜、铁载体合成能力；通过体内小鼠感染实验分析Fis对肺炎克雷伯菌致病力的影响。结果肺炎克雷伯菌fis基因缺失后细菌生长速度明显降低，荚膜合成能力增强，铁载体产生降低，而生物被膜合成能力无差异。通过小鼠腹腔感染实验发现肺炎克雷伯菌fis基因缺失后细菌的致病力下降。结论本研究证实肺炎克雷伯菌Fis调控子可通过影响细菌生长速度、荚膜形成及离子利用而影响细菌的致病力。

关键词：
Fis
毒力
肺炎克雷伯菌
致病性
调控因子
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肺炎克雷伯菌为肠杆菌科细菌，是一种主要的人类病原体[1]。其可存在于环境（土壤和表层水）和非生物表面（例如医疗器械），亦可定植于人类粘膜表面（特别是口咽和胃肠道），在机体免疫力下降等情况下侵入其他组织引起肺炎、脑膜炎、血流和泌尿系统感染[2,3,4]。高致病性肺炎克雷伯菌也可在健康个体中引起肝脓肿、眼内炎等[5]。随着高致病性肺炎克雷伯菌感染率上升及多重耐药肺炎克雷伯菌菌株的增加[3,4,5,6]，对肺炎克雷伯菌致病机制的深入了解将帮助我们更好地预防和控制相关感染性疾病。

Fis是一种核相关蛋白（nucleoid-associated protein),Fis蛋白最初被鉴定为大肠埃希菌同源Hin和Gin位点特异性DNA重组酶反转刺激的因子。其作用包括调节细菌毒力因子和优化细菌对各种环境的适应等[7]。有研究表明Fis在致病性大肠埃希菌菌株、福氏志贺菌、沙门氏菌[8]、弧菌霍乱弧菌和菊欧文氏菌等[9,10]的调控网络中发挥着重要作用，是多种致病菌毒力的关键调节因子。但其在肺炎克雷伯菌中的作用特别是在对致病相关因素方面的调控作用尚不清楚。为了进一步了解肺炎克雷伯菌致病机制，本研究聚焦肺炎克雷伯菌调控因子Fis，构建其基因缺失株与回补株并分析Fis调控子在细菌生长、生物膜形成、荚膜合成及离子获得过程中的作用。

1、材料与方法

1材料

1.1菌株、质粒肺炎克雷伯菌

NTUH-K2044菌株(K1血清型，分离自肝脓肿患者浓汁)、Escherichia coli DH5α菌株、温度敏感型自杀载体pKO3-km(卡那霉素抗性)、回补质粒pGEM-T-easy由本实验室保存。

1.2主要试剂

引物琼脂粉、酵母粉、蛋白胨、NaCl为OXOID公司产品；氨苄青霉素(ampicillin, AMP)、硫酸卡那霉素(kanamycin, KAN)为Biotopped公司产品；各种酶与分子Marker为Takara公司或Promega公司产品；PCR产物纯化、切胶回收、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；Zwittergent3-14、间羟基联苯、柠檬酸、NaOH、硼酸购自sigma或国药集团化学试剂有限公司。引物由上海生工生物公司合成，序列见表1。

表1引物序列

2方法

2.1构建fis基因缺失突变株和回补株fis基因

敲除方法参考文献[11]。利用基因敲除技术(基于同源重组原理),通过融合PCR获得fis基因上下游侧翼序列的PCR产物，克隆至温度敏感型自杀载体pKO3-Km上，获得pKO3-Km-fis质粒，将此质粒电转至肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株，通过同源重组的方法以及蔗糖反向筛选获得fis基因缺失株Δfis,然后将包含fis基因编码区及上游启动子结合区和下游转录终止区的PCR片段克隆入质粒pGEM-T-Easy中，电转至敲除株获得回补株C-fis。

2.2生长曲线取保存的WT,Δfis与C-fis甘油菌

分别接种于3 mL新鲜LB液体培养基中，37℃,200 r/min培养过夜。次日，取过夜活化的菌液1∶100转接至新的3 mL LB液体培养基中，培养至A600约为1.6,调整A600值约1.2,之后1∶100转接于新的LB液体培养基中，37℃振荡培养，利用全自动细菌生长仪检测、绘制生长曲线。

2.3生物被膜形成实验细菌培养

如上所述，取A600值约1.2的WT、Δfis及C-fis菌液转接至干净透明的无菌玻璃试管中，37℃静置培养24 h及48 h后分别观察三株菌的生物被膜形成情况。

2.4荚膜检测实验

荚膜离心试验：将不同菌株过夜培养菌液1%比例转接至新鲜LB培养基中，培养至A600约1.5,各取等量菌液12 000 r/min离心5 min观察细菌沉淀量并测量上清液A600值，分析细菌荚膜产生情况。

荚膜定量实验：取-80℃保存的不同菌株(WT、Δfis及C-fis)培养过夜后1∶100转接至新鲜LB培养基中培养至对数期(A600大约1.6-1.8),调至A600约2.0(细菌计数),取500μL LB培养基中培养的样品与100μL含有1% Zwittergent3-14洗涤剂的100 mmol/L柠檬酸混合，然后在50℃下孵育30 min。12 000 r/min离心10 min后，将250μL上清液转移至新管中，并添加1 mL无水乙醇。之后在4℃沉淀30 min,然后将样品离心5 min,将沉淀溶解在100μL蒸馏水中，然后将600μL 12.5 mmol/L硼酸H2SO4溶液添加到每个样品中。将样品煮沸5 min,然后添加1.5 mg/mL间羟基联苯溶于5 mg/mL NaOH,涡旋5 min,最后测量520 nm处的吸光度，并从葡萄糖醛酸的标准曲线确定荚膜的量，以μg/109 CFU表示[12]。

2.5铁载体含量检测实验

过夜培养的细菌活化后调整A600约1.2后分别取5μL菌液滴至CAS固体培养基，37℃培养24 h以上，观察菌落周围螯合圈大小，测量直径判断细菌生成铁载体含量。同时，将菌液按1∶100转接CAS液体培养基中37℃、200 r/min震荡培养24 h以上，使用CAS检测液测取630 nm处的吸光度(As),得到细菌铁载体的相对含量，从而判断其铁代谢的能力。

2.6小鼠感染实验

取过夜培养的细菌菌液按1%比例转接入LB液体培养基中，培养至细菌生长对数期(A600值约为1.6),取1 mL菌液，25℃、12 000 r/min离心10 min,弃去上清，将菌体用磷酸缓冲盐溶液洗涤重悬，重复两次，调整细菌浓度为1×105 CFU/mL备用。将36只BALB/c小鼠随机分为3组(每组12只)。分别腹腔注射100μL WT,Δfis与C-fis菌株(1×104 CFU),每日观察小鼠生存状况，计算小鼠存活率。

2.7统计分析

本研究统计方法为非配对双尾t检验(two-tailed Student’s t test)和Kaplan-Meier法(log-rank和Gehan-Breslow-Wilcoxon)。相关图表使用GraphPad Prism 8生成。

2、结果

1成功构建fis基因缺失肺炎克雷伯菌突变株及回补株

通过PCR对不同菌株进行鉴定，结果显示：当以敲除外部引物fis-A/fis-D扩增时，WT扩增片段为1 417 bp,而Δfis扩增片段为1 127 bp,两者相差290 bp;当用内部引物fis-F/fis-R扩增时，WT、C-fis扩增片段为105 bp,而Δfis未扩增出片段。说明成功构建肺炎克雷伯菌fis基因的缺失株及回补株(图1)。

图1肺炎克雷伯菌fis基因缺失株与回补株的鉴定

2 fis基因缺失影响细菌生长

利用全自动细菌生长仪检测、绘制WT、Δfis及C-fis在LB培养基中生长曲线，结果显示，Δfis菌株的生长速度显著低于WT(P<0.01),生长在C-fis得到一定程度的恢复(图2),说明fis基因缺失可影响肺炎克雷伯菌在体外生长。

图2菌株WT、Δfis和C-fis体外生长曲线

3 fis基因缺失不影响细菌生物被膜形成

生物被膜是肺炎克雷伯菌重要致病相关因子，为探究fis基因是否影响肺炎克雷伯菌生物被膜的形成，利用试管法将WT,Δfis及C-fis菌株分别在LB培养基中37℃静置培养24 h或48 h后观察液-气交界处生物膜形成情况。结果显示，在LB液体培养基中不同菌株生物被膜的形成无明显差异，fis基因不影响肺炎克雷伯菌生物被膜的形成(图3)。

图3 WT、Δfis及C-fis生物被膜形成

4 fis基因缺失影响细菌荚膜合成

除生物膜外，荚膜是肺炎克雷伯菌重要致病相关因子。高速离心实验发现，fis基因缺失株在12 000 r/min离心5 min后形成的沉淀较WT更加松散，上清液A600明显高于WT株(图4A、B)。高速离心实验细菌的沉降速率与细菌荚膜含量相关，该实验结果说明Fis调控子可能负调控细菌荚膜形成。荚膜定量实验亦证明Δfis菌株荚膜量显著高于WT及C-fis株(图4C),fis基因负调控肺炎克雷伯菌荚膜的合成。

图4 fis基因缺失影响细菌荚膜合成

5 fis基因缺失影响细菌铁载体的产生

铁载体也是肺炎克雷伯菌重要致病相关因子。利用CAS固体与液体培养基分别检测野生株、突变株及回补株生成铁载体的含量。从图5A中可以看出，在CAS固体培养基中Δfis菌株(直径约1.1 cm)周围的螯合圈明显小于野生株(直径约1.6 cm)与回补株(直径约1.3 cm),野生株与回补株的螯合圈直径无明显差异。定量分析CAS液体培养基中三种菌产生的铁载体含量，测630 nm处的吸光度计算三种菌产生铁载体的相对含量(图5B)。结果显示Δfis产生的铁载体含量少于WT和C-fis,与CAS固体培养基定性实验的检测结果相符。fis基因缺失减弱了肺炎克雷伯菌产生铁载体的能力，影响细菌的离子应用。

图5 fis基因缺失对细菌铁载体产生的影响

6 fis基因缺失影响细菌致病力

为确定fis基因对肺炎克雷伯菌致病力的影响，分别将104 CFU WT、Δfis及C-fis通过腹腔注射途径感染BALB/c小鼠，记录感染后小鼠死亡情况绘制存活率曲线图。生存率曲线结果显示，在感染后2 d及4 d内，野生株、回补株腹腔感染小鼠分别全部死亡，而Δfis株感染小鼠14 d内存活率达83.3%(P<0.01)(图6),表明fis基因缺失会减弱细菌致病性。Fis调控子调控肺炎克雷伯菌致病力。

图6 WT,Δfis及C-fis腹腔感染BALB/c小鼠的存活率

3、讨论

肺炎克雷伯菌是一种较为常见的革兰阴性机会致病菌，在免疫功能低下的个体中可引起菌血症、肺炎和肝脓肿等多种感染性疾病[13,14]。20世纪80年代以来，高致病型肺炎克雷伯菌被发现可在年轻和相对健康的个体中引起感染[15]。目前已经发现多种致病相关因子如荚膜多糖、脂多糖、菌毛、外膜蛋白和铁载体参与肺炎克雷伯菌致病过程，有利于细菌在宿主体内生存和逃避宿主免疫[4]。而且毒力基因的表达与整体细胞功能相协调[16]。据估计，65%～80%的细菌感染与生物膜有关，肺炎克雷伯菌在宿主可导致泌尿道、胃肠道和呼吸道等部位的定植，及后续对宿主的侵袭性感染，与其生物膜密切相关[14]。生物膜是复杂的细菌群落，由一种或多种包裹在细胞外基质中的物种组成，生物膜中的细菌可免受免疫反应和抗生素的影响[3]。研究中通常采用光滑的管壁内表面以观察肺炎克雷伯菌生物膜的形成。荚膜多糖(CPS)和菌毛是肺炎克雷伯菌重要的表面结构。其中，荚膜多糖参与肺炎克雷伯菌生物膜的形成并介导细胞间通讯；菌毛参与肺炎克雷伯菌在宿主中的粘附[14]。

调控因子在细菌感应环境变化调控致病相关因子表达的过程中起着非常重要的作用。对于肺炎克雷伯菌，已经有研究证明多个调控因子与细菌致病相关。例如RcsAB和Fur调控肺炎克雷伯菌铁获取系统[17];双组分系统OmpR通过肺炎克雷伯菌的能量代谢调节细菌粘度和毒力[18];oxyR缺失株荚膜多糖(CPS)合成降低，减弱了对线虫感染模型的致病性[19];RmpA可参与FNR介导的cps转录抑制，从而调节CPS量、血清抗性和抗吞噬作用[20],也可以直接作用于cps簇启动子，促进荚膜的产生，可增强肺炎克雷伯菌对大蜡螟幼虫的毒力[21];CRP(cAMP受体蛋白)负调节荚膜合成，促进生物膜形成，增强菌毛活性而正向调节细菌毒力[22]。虽然在调控因子对肺炎克雷伯菌致病性方面已经有一定研究，但仍有许多未知的机制。

全局性调控因子Fis是一种生长阶段依赖性、类核相关蛋白，在不同细菌物种中的许多基因的转录调节中发挥作用。在大肠埃希菌中，Fis是最丰富的蛋白质之一，在有氧生长条件下，在早期指数期细胞中高度表达，但在稳定期细胞中消失。Fis是大肠埃希菌和沙门氏菌中DNA负超螺旋所必需的[23]。在菊欧文氏菌潜伏感染阶段，Fis抑制纤维素的产生(纤维素是菊欧文氏菌生物膜的主要成分),并激活鞭毛产生促进浮游生活方式和宿主细胞间隙的定植[9]。在副溶血弧菌中，Fis连接群体感应和表面感应来控制细菌的运动[23]。在铜绿假单胞菌中，Fis通过调节脓毒素合成及exsA的转录影响细菌对环丙沙星的耐药性及III型分泌系统[24,25]。在多杀性假单胞菌中，Fis可调节细菌铁的吸收及毒力[26]。本研究发现fis基因敲除后细菌通过腹腔途径感染时致病力降低，但不影响细菌生物膜的形成并且促进了荚膜的合成，说明细菌致病力的降低与调控荚膜及生物膜的合成关系不大。肺炎克雷伯菌在fis基因缺失后的生长能力及铁离子获取能力有所下降，这也许是影响细菌致病力的因素。关于fis基因具体如何调控细菌的致病性及调控机制课题组将会进一步进行研究。

基金资助:湖北省卫生健康委面上项目(No.WJ2021M056);湖北医药学院基础医学院研究生创新基金项目;

文章来源:马仁惠,谢继臣,全秋航,等.调控因子Fis对肺炎克雷伯菌致病力影响与机制研究[J].中国病原生物学杂志,2024,19(04):436-440.