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实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究

2024-06-03 125 上传者：管理员

摘要：目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列，设计特异性引物和探针，建立猴痘病毒RT-PCR检测方法，并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测；对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测，对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测，与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应，检测重复性好，最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法，可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。

关键词：
F3L基因
实时荧光定量PCR
快速检测方法
猴痘病毒
病毒性疾病
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猴痘是由猴痘病毒(mpox virus)感染引起的病毒性疾病。猴痘病毒是痘病毒科正痘病毒属的一种线性双链DNA病毒，是已灭绝的天花病毒的近源病毒，包括西非和中非两个遗传分支[1]。猴痘被认为在非洲地区以外发病率较低。然而，自2022年5月7日英国报告首次人类猴痘病毒病例以来，猴痘病毒感染病例在全球范围内发生。在接下来的几个月里，50多个国家和6个地区报告了更多的猴痘病例。因此，世界卫生组织于2022年6月23日宣布猴痘对全球公共卫生已构成“中度风险”。国家卫生健康委员会也下发了《猴痘防控技术指南(2022年版)》,其中提及猴痘疫情概况、疾病描述、猴痘检测、预防、诊断等多个方面的内容[2]。猴痘的治疗目前大多是采取对症治疗，尚无特异性的药物可用。Adler等[3]发表的一项回顾性研究描述了猴痘患者服用tecovirimat或brincidofovir药物进行治疗后的临床症状、抗病毒药物反应等，结果显示，服用tecovirimat的猴痘患者没有不良反应，住院治疗时间比服用brincidofovir的患者更短，提示tecovirimat对猴痘感染患者的治疗可能有一定效果。接种疫苗是预防病毒感染的有效手段，但目前没有批准可用的猴痘疫苗，研究数据表明接种天花疫苗可对猴痘提供交叉保护作用，保护率约可达到85%[4]。Zuiani等[5]设计了一种针对猴痘病毒和相关正痘病毒的多价mRNA疫苗BNT166,研究发现其可以保护小鼠和猕猴免受猴痘病毒和部分正痘病毒的侵害，此疫苗的临床评估实验正在进行中。

猴痘病毒的快速检测对于猴痘病例的及时诊断以及猴痘疫情的控制至关重要，建立猴痘病毒的快速检测方法十分必要。目前多种核酸检测方法已被研究用于猴痘病毒的检测，如普通PCR、实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR, RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RAA)、微滴法PCR等，其中RT-PCR具有特异性好、灵敏度高等特点，被广泛用于临床样本、环境样本以及食品样本中的微生物检测[6,7,8]。本研究拟以猴痘病毒F3L基因的保守区段为靶标设计RT-PCR特异性引物和探针，建立猴痘病毒的RT-PCR快速检测方法，为猴痘感染的及时发现及防控提供技术支持。

1、材料与方法

1.1实验材料

由人5型复制缺陷型腺病毒(Ad5)构建的猴痘假病毒Mpox-F3L购自上海生工生物工程有限公司。人冠状病毒、乙型流感、呼吸道合胞病毒A/B、副流感、人类偏肺病毒、人类肠道病毒71、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒、人类博卡病毒、鼻病毒、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和金黄色葡萄球菌均分离自临床样本，由本实验室保存。将猴痘病毒F3L基因序列(GenBank: AF380138),天花病毒(GenBank: LR800245)、痘苗病毒(GenBank: MT227314)和牛痘病毒(GenBank: MK035759)的F3L基因同源区，克隆到载体pUC57中分别得到重组质粒pUC57-F3L、pUC57-variola-F3L、pUC57-vacciniae-F3L和pUC57-cowpox-F3L,重组质粒均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2主要试剂与仪器

蛋白胨、酵母粉(Oxid);QiagenDNA提取试剂盒(德国Qiagen公司);SuperReal荧光定量预混试剂(探针法)(天根生化科技有限公司);高纯度质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司);引物、探针(上海生工生物工程有限公司合成);猴痘病毒核酸检测试剂盒PCR-荧光探针法(北京开景基因技术有限公司);台式离心机(Thermo Fisher Scientific,美国);恒温培养箱(Thermo Fisher Scientific,美国);荧光定量PCR仪(博日生物科技有限公司);Nanodrop核酸定量仪(Thermo Fisher Scientific,美国)。

1.3猴痘病毒RT-PCR引物和探针设计

从NCBI网站下载猴痘病毒F3L基因(GenBank: AF380138)序列，以F3L基因为靶基因，用软件设计引物和探针，引物和探针序列(表1)。探针的5′末端用FAM荧光染料标记，3′末端用BHQ荧光猝灭剂标记。然后使用OligoEvaluator软件评估引物和探针的鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量和二级结构(http: //www.oligoevaluator.com)。

表1猴痘病毒F3L基因引物与探针序列

1.4重组质粒提取

接种环蘸取少量甘油保存菌在LB平板划线后，37℃倒置培养12～16 h,挑取单克隆至LB液体培养基中，37℃,180 r/min培养12～16 h;吸取50μL菌液至5 mL LB液体培养基中，37℃,180 r/min培养12～16 h;取新鲜菌液2 mL至干净EP管中，12 000 r/min离心，吸弃上清，按照天根高纯度质粒小提试剂盒的说明书，提取质粒。使用Nanodrop测定质粒浓度，质粒拷贝数的计算方法如下：DNA拷贝数(拷贝数/μL)=[6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9]/[片段长度(nt)×660]。

1.5 RT-PCR扩增反应

RT-PCR反应体系总体积30μL,包括以下组分(表2):15μL 2×SuperRealPreMix(Probe)、0.9μL上游引物MF3L-F(10μmol/L)、0.9μL下游引物MF3L-R(10μmol/L)、0.6μL探针MF3L-probe(10μmol/L)、2μL DNA模板和10.6μL ddH2O。RT-PCR的反应条件：在95℃10 min; 94℃10 s, 60℃45 s共40次循环。循环阈值(Ct)<37被确定为阳性样本。

表2猴痘病毒RT-PCR反应体系配制

1.6猴痘病毒RT-PCR方法特异性检测

使用Qiagen公司DNA提取试剂盒提取病毒分离株和细菌分离株的总DNA作为模板，以及重组质粒pUC57-variola-F3L、pUC57-vacciniae-F3L和pUC57-cowpox-F3L作为模板，进行RT-PCR反应扩增，用ddH2O作为阴性对照，质粒pUC57-F3L为阳性对照，检测猴痘病毒RT-PCR的特异性。

1.7猴痘病毒RT-PCR方法灵敏度检测

猴痘重组质粒pUC57-F3L先稀释成1010 copies/μL,然后10倍比稀释成105、104、103、102、101、100 copies/μL等多个浓度，分别取2μL作为模板进行RT-PCR反应，然后根据结果绘制标准曲线，并计算最低检测限值。

1.8临床样本中猴痘病毒的检测

取适量Randox公司赠予的皮肤脓拭子疑似阳性临床样本DNA,按照如下反应体系进行检测：15μL 2×SuperRealPreMix(Probe)、0.9μL MF3L-F(10μmol/L)、0.9μL MF3L-R(10μmol/L)、0.6μL MF3L-probe(10μmol/L)、2μL DNA和9.6μL ddH2O。以ddH2O为阴性对照，以重组质粒pUC57-F3L为阳性对照。同时用购买的猴痘病毒核酸检测试剂盒对临床样本DNA进行检测，对两种方法的检测结果进行对比分析。

2、结果

2.1猴痘病毒RT-PCR检测方法的建立

使用靶向猴痘病毒F3L基因设计的引物和探针，对重组质粒pUC57-F3L进行检测，ddH2O作为阴性对照，扩增曲线如图1所示，阳性质粒有扩增曲线，阴性对照无扩增曲线。

2.2特异性检测

将实验室保存的病毒、细菌等的DNA作为模板，以及合成的重组质粒pUC57-variola-F3L、pUC57-vacciniae-F3L和pUC57-cowpox-F3L作为模板，进行RT-PCR扩增反应。扩增结果如图2所示，仅阳性质粒pUC57-F3L有扩增曲线，其余样本均无扩增曲线，表明该方法可以特异性检测猴痘病毒。

图1 RT-PCR扩增曲线

图2 RT-PCR特异性检测曲线

序号1～24分别为pUC57-F3L、pUC57-variola-F3L、pUC57-vacciniae-F3L、pUC57-cowpox-F3L、人冠状病毒、乙型流感、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B、副流感、人类偏肺病毒、人类肠道病毒71、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒、人类博卡病毒、鼻病毒、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和金黄色葡萄球菌。

2.3灵敏度检测、检测限以及标准曲线

猴痘重组质粒pUC57-F3L稀释成108、107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μL等浓度梯度，分别取2μL进行RT-PCR反应，扩增结果见图3。当模板浓度是103 copies/μL时，仍然有扩增曲线，Ct值为36.93,所以检测灵敏度为103 copies/μL。根据灵敏度结果绘制标准曲线见图4,在模板浓度为108～104 copies/μL范围内，RT-PCR标准曲线公式为y = -3.32x + 43.594,相关系数为0.998 7,有较好的扩增效果。

图3 RT-PCR灵敏度检测曲线

图4 RT-PCR标准曲线

2.4重复性检测

分别以106、105、104 copies/μL共3个不同浓度的猴痘重组质粒pUC57-F3L为模板进行RT-PCR反应，每个浓度进行5次重复实验，扩增曲线见图5,检测结果标准偏差值见表3。3组不同浓度质粒扩增结果具有很好的重复性，组内Ct值差异小，Ct值变异系数分别为0.44%、1.10%、0.31%。

图5 RT-PCR重复性检测曲线

表3 RT-PCR检测结果标准偏差

2.5临床样本检测

为了评估RT-PCR的检测效果，取Randox公司赠予的10份疑似猴痘阳性皮肤脓拭子临床样本DNA,按照1.2所述的反应体系进行RT-PCR检测。结果如图6A所示，临床样本m1、m3、m8和m10有明显的扩增曲线，其余样本均为阴性样本。同时用市售猴痘病毒核酸检测试剂盒对样本进行检测，检测结果与本研究建立的RT-PCR方法的检测结果一致(图6B)。

图6临床样本RT-PCR检测结果

3、讨论

猴痘病毒是人畜共患疾病猴痘的致病病毒，最早于1958年在实验室猴子身上发现[9],19世纪70年代在刚果民主共和国发现了第一例人类猴痘感染病例[10]。猴痘主要在西非和中非发生，近些年，非洲以外的中国、新加坡、以色列、美国、英国等许多国家和地区报道了猴痘病例[11,12,13,14]。猴痘病毒主要通过密切接触污染源进行传播，猴痘病毒感染引起的临床症状有皮疹、发烧、头痛、淋巴结肿大等，和天花的临床症状相似。一般情况下，皮疹最先在面部出现，然后扩散到身体的其他部位，皮疹会发展为黄斑、丘疹、小泡、脓包，最终结痂。由于猴痘在不同国家和地区频繁发生，且引发的死亡率升高[15],实现其早期快速诊断对于感染的及时发现和防止病毒传播都至关重要。

本研究参考国内外相关文献以及国家卫生健康委员会发布的猴痘防控技术指南，将猴痘病毒与天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒的基因组序列进行比对，选择了双链RNA结合蛋白区F3L基因[16,17,18]相对保守的区段设计特异性的引物和探针，建立了猴痘病毒RT-PCR检测方法。以往的猴痘病毒RT-PCR检测方法建立研究[16,17,18]多选择F3L基因200～400 bp区段的序列为模板进行引物和探针设计，本研究尝试选择了F3L基因200 bp前的序列作为模板设计引物和探针，然后对方法的特异性、灵敏度、重复性和临床样本检测效果进行评价。特异性检测实验部分，本研究对多种常见致病病毒和细菌的核酸进行检测，均无非特异性扩增，表明此方法可以实现猴痘病毒的特异扩增。但不足之处是因为没有天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒的核酸，所以在特异性实验时，分别使用了含有这3种病毒F3L基因同源序列的重组质粒作为模板进行检测。在灵敏度检测部分，本研究构建了包含猴痘病毒F3L基因序列的重组质粒，将质粒稀释成不同浓度后作为模板进行RT-PCR检测，得出检测限为103 copies/μL,检测限值与幸芦琴等[18]的研究结果接近，但相比于其他研究的结果无显著优势。重复性实验结果显示，本方法对3个不同浓度质粒的检测结果重复性很好，不同浓度组内Ct值的标准偏差小于其他猴痘病毒RT-PCR检测方法[18]。最后，本研究使用公司赠予的猴痘临床样本核酸，对所建立的猴痘病毒RT-PCR检测方法的检测效果进行了验证，并与市售猴痘病毒核酸检测试剂盒的检测结果进行对比，两种方法检测到的阳性样本数一致，表明本研究建立的猴痘病毒RT-PCR方法能达到与市售试剂盒一致的检测效果。国内发表的猴痘病毒检测方法的相关研究中，多数是使用模拟样本对方法进行验证，本方法的检测效果在临床样本中得到了验证，具有更好的参考价值。

RT-PCR在近些年被广泛用于各类病原体检测，技术方法成熟，相比于其他传统方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等多个优点，RT-PCR检测用到的仪器是实验室或医院检验科常见仪器，成本较低，容易在科研、医疗、食品等多个领域得到研究与推广，有很好的应用前景。

参考文献:

[2]国家卫生健康委员会.猴痘防控技术指南(2022年版)[J].中国病毒病杂志,2022,12(4):245-254.

[16]孔玉方,王慧煜,吕继洲,等.猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2023,53(4):448-454.

[17]朱娜,陈国强,张敬友,等.猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].南京农业大学学报,2009,32(4):165-168.

[18]幸芦琴,李小波,郑夔,等.猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立[J].现代预防医学,2008,35(11):2110-2112.

文章来源:冯俊霞,陈锦峰,崔晓虎,等.实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究[J].遵义医科大学学报,2024,47(05):508-512+521.