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荧光染色法在孢子丝菌病组织病理诊断中的应用

2024-09-05 78 上传者：管理员

摘要：目的：探讨荧光染色法在孢子丝菌病组织病理切片的致病菌检测的应用价值，为孢子丝菌病的诊断提供新方法。方法：收集北华大学附属医院皮肤科就诊的疑诊孢子丝菌病患者的临床资料，取患者皮损处组织，分别进行真菌培养和组织病理学检查，对石蜡包埋组织进行平行试验，染色方法包括苏木精-伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色和基膜六胺银（PASM）染色和真菌荧光染色，以真菌培养阳性为金标准，比较其阳性率和染色效果。采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。结果：45例临床疑诊孢子丝菌病患者真菌培养阳性36例（80.00%）,HE染色均为非特异性肉芽肿性改变，PAS染色阳性30例（66.67%）,PASM染色阳性30例（66.67%），荧光染色阳性40例（88.89%）。由真菌培养阳性病例中染色方式与阳性率的交叉列联表及卡方检验结果可知，染色方式与阳性率存在显著的相关关系（P<0.05）;9例真菌培养阴性的疑诊孢子丝菌病患者，荧光染色阳性4例，HE、PAS及PASM染色法结果均阴性。结论：荧光染色法检测孢子丝菌病患者组织切片中病原体阳性率高，具有高灵敏、高特异性的优点，可为临床诊断提供依据，具备临床应用前景。

关键词：
孢子丝菌病
真菌培养
组织病理学检查
荧光染色法
诊断
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孢子丝菌病临床常用的诊断方式是真菌培养和组织病理检查。真菌培养培养周期长，易受到污染菌影响；组织切片染色方式包括苏木精-伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色和基膜六胺银（PASM）染色，但这些方法的真菌阳性检出率不高，且存在耗时长、操作环节复杂和镜下难观察等缺点。有学者采用荧光染色法检测深部、浅表及脑脊液样本真菌感染，结果显示用荧光染色法诊断真菌感染疾病是可行且有效的[1]。刘晓雨等[2]采用改良荧光染色法检测21例皮下真菌病患者组织中真菌阳性率高于传统的HE和PAS染色法。在孢子丝菌病中应用荧光染色法检测致病菌在国内外还缺乏广泛报道。本研究以真菌培养为金标准，比较疑诊孢子丝菌病患者的组织病理切片中HE、PAS、PASM及真菌荧光染色法的真菌检测的阳性率，探讨荧光染色法在孢子丝菌病组织病理诊断中的应用价值。

1、病例和方法

1.1病例资料

收集2021年1月—2022年12月在北华大学附属医院皮肤科就诊的45例疑诊孢子丝菌病患者的临床资料。男23例（51.11%），女22例（48.89%）；年龄30～78岁；病程1个月～2.5年；固定型25例、淋巴管型20例；面部16例，上肢28例，躯干1例；外伤史及蚊虫叮咬史35例。近3个月未用过抗真菌药物。

1.2方法

1.2.1主要试剂

真菌荧光染色液CFW（钙荧光白）-Ⅱ（A液，B液）（珠海丰炎科技有限公司）；PASM（珠海贝索生物科技有限公司）；PAS（珠海贝索生物科技有限公司）；HE（珠海贝索生物科技有限公司）。

1.2.2真菌培养

将疑诊孢子丝菌患者皮损处的组织标本接种在沙堡葡萄糖蛋白胨琼脂（SDA）培养基上，分3点接种，在25℃下培养3 d后，每日对培养结果进行观察、判读，持续观察2周，以第14天为最终判读结果，然后将阳性培养标本挑出进行菌种鉴定[3]。

1.2.3组织病理检查

用手术切取或者环钻取孢子丝菌病疑诊患者的新鲜组织做组织病理检查（包括HE染色、PAS染色、PASM染色及真菌荧光染色）[3-4]。真菌荧光染色：首先使用防脱玻片，石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水稍洗，切片平放，稍晾干，后滴加CFW荧光染色液一滴，混匀，再轻轻加盖洁净盖玻片一张，1 min后即可在荧光显微镜下镜检[2]。

1.2.4结果判定

真菌培养阳性为灰色、棕色或者黑色菌落，镜下观察菌丝可见纤细的分枝分格菌丝，分生孢子球形、椭圆形，如呈花朵样[3]。HE染色表现为真皮非特异性肉芽肿或成熟皮损典型改变为“三区病变”[4]，提示有真菌感染，可见椭圆形孢子为阳性。PAS染色阳性可见圆形、卵圆形、雪茄烟形小体上及星状体，PASM染色阳性可见黑褐色圆形或卵圆形酵母细胞[4]。真菌荧光染色阳性可见深蓝色背景下，亮蓝色荧光的椭圆形酵母细胞[5]。

1.3统计学方法

使用SPSS(Version 24.0）软件对结果进行统计分析，采用χ2检验，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

本研究共纳入45例临床高度疑诊孢子丝菌病患者。真菌培养阳性36例（80.00%）（图1A),HE染色均为非特异性肉芽肿性改变（图1B），阳性0例，PAS染色阳性30例（66.67%）（图1C),PASM染色阳性30例（66.67%）（图1D），荧光染色阳性40例（88.89%）（图1E）。

2.1真菌培养阳性结果中PAS、PASM染色和真菌荧光染色阳性率

真菌培养36例阳性，其中HE染色提示均为非特异性肉芽肿改变0例，PAS染色阳性30例（83.33%),PASM染色阳性30例（83.33%），荧光染色阳性36例（100%）（表1）。

2.2真菌培养阴性结果中PAS、PASM染色和真菌荧光染色阳性率

对9例真菌培养阴性的疑诊孢子丝菌病患者的临床表现、流行病学和病史等评估后，仍高度疑诊孢子丝菌病，荧光染色法4例阳性（44.44%),HE、PAS及PASM染色法结果均阴性（表2）。

2.3 4种诊断方法对比

真菌荧光染色法检测孢子丝菌病检出速度、操作步骤及镜下结果判读难易均明显优于HE染色、PAS和PASM染色（表3）。

PAS和PASM染色镜下难观察（图1C、D）。

3、讨论

孢子丝菌病是一种深部真菌病，感染皮肤、皮下组织和附近淋巴组织，以固定型、皮肤淋巴管型最为常见,流行病学显示多发于南美洲和亚洲，在我国集中于东北地区[6]。临床中通常采用真菌培养和组织病理学诊断相结合的方式以提高真菌检出率。真菌培养法虽然是金标准，但培养周期长，易受到污染菌影响；组织病理学检查HE染色并不能很好的观察到真菌结构，通常采用特殊染色（PAS染色和PASM染色），然而这两种特定的染色方法存在一些不足之处，如染色步骤繁琐、真菌检出率较低[4,9]。其他诊断方法包括直接显微镜检查、孢子丝菌素皮肤试验、分子技术诊断和血清学诊断等均较难应用于临床[7-10]。

近年来，不断有学者报道荧光染色法应用于浅部真菌病、白念珠菌感染及临床常规组织切片以及手术中的快速冰冻切片的真菌检出及诊断[1,11]。CFW是二苯乙烯类化合物，是一种非特异性荧光染料，能非特异性地结合和β-1,3-和β-1,4-糖苷键连接的多糖，多种植物和真菌胞壁的几丁质和纤维素中均有该成份[3]，对其有着很强的亲和力，在一定波长的紫外光下，被染色的真菌会发出很强的亮蓝色荧光，且操作简便[2,6]。

本研究以真菌培养为金标准，使用荧光染色法对组织切片染色，与HE染色、PAS染色、PASM染色对比。45例临床高度疑诊孢子丝菌病患者，真菌培养阳性36例（80.00%),HE染色法均显示真皮非特异性肉芽肿，均未见孢子及菌丝，PAS及PASM染色阳性30例（66.67%），荧光染色阳性40例（88.89%）；真菌培养阴性的9名患者中，荧光染色4例阳性，HE、PAS及PASM染色均阴性。真菌荧光染色对组织病理切片的孢子丝菌检测阳性率优于PAS和PASM染色。刘晓雨等[2]研究者收集了21例皮下真菌感染患者的石蜡包埋皮损组织，包括孢子丝菌感染12例，发现改良CFW荧光染色法检测真菌阳性率高于HE和PAS染色法，这与研究结果相一致，提示荧光染色法检测孢子丝菌病患者组织切片中病原体阳性率高，具有高灵敏、高特异性的优点。

荧光显微镜下能够更容易看到发出亮蓝色荧光的孢子，染色中使用的10%KOH能有效地降低组织背景，更好的呈现真菌形态，能够更有效的标记孢子，更易发现典型结构，可视化更佳[6]。与真菌培养、HE染色、PAS染色和PASM染色法相比，真菌荧光染色操作步骤简便、快速。在应用荧光染色法检测真菌样本时，也存在着不足，如染色样本无法长期保存留档，对于已染色样本的保存仍存在缺陷[2]，有待于改进。

图1孢子丝菌病患者皮损真菌培养、组织病理及免疫荧光像

表1真菌培养阳性患者染色方法与阳性率的交叉列联表

表2真菌培养阴性患者染色方法与阳性率的交叉列联表

表3 4种诊断方法优劣势对比表

参考文献:

[1]赵琳,乔昀.荧光染色法在真菌检测中的应用[J].检验医学,2021, 36(12):1219-21.

[2]刘晓雨,梁官钊,郭健,等.改良荧光染色法在皮下真菌病组织病理诊断中的应用分析[J].中华皮肤科杂志,2019, 52(5):319-322.

[3]王端礼.医学真菌学-实验室检验指南[M]. 1版.北京:人民卫生出版社,2005.128-129.

[4]林倩,方庆全.病理组织PAS染色影响因素分析[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2020, 29(01):77-80.

[5]杨通,何炼图,陈涛,等.荧光染色剂Calcofluor White在活检组织中真菌染色的应用[J].分子诊断与治疗杂志,2014, 6(05):307-311.

[6]李珊山,刘鹤松,郑华,等.皮肤型孢子丝菌病585例临床分析[J].中华皮肤科杂志,2011, 44(3):161-164.

基金资助:吉林省自然科学基金(No:20210101241JC)资助项目;