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人卵巢癌皮下移植瘤生长及CD34和VEGF表达受人脐带间充质干细胞的影响研究

2020-08-08 238 上传者：管理员

摘要：目的研究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对卵巢癌皮下移植瘤生长及CD34和VEGF表达的影响。方法培养SKOV3细胞及hUC-MSCs细胞,并建立15只裸鼠卵巢癌皮下移植瘤。成瘤后随机分为对照组、实验组1及实验组2,每组5只。向个实验组卵巢癌荷瘤裸鼠背部瘤体内分别注射hUCMSCs1×106和2×106个,每隔1周注射1次,一共注射3次,正常对照组注射生理盐水。实验开始后每隔3天观察瘤体体积变化。直至观察结束将裸鼠处死并取出肿瘤组织。免疫组化法检测CD34,VEGF的表达水平。结果实验组肿瘤体积在整个观察期间均小于对照组,且在一定浓度范围内,hUC-MSCs浓度越高其体积越小,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组CD34和VEGF表达量较对照组相比均明显降低,且在一定的浓度范围内随浓度增高而降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 hUC-MSCs可抑制卵巢癌皮下移植瘤的生长及CD34和VEGF的表达。为治疗卵巢癌提供了新思路。

关键词：
CD34
人脐带间充质干细胞
卵巢癌
恶性肿瘤
血管内皮生长因子(VEGF)
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卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度较高。死亡率占妇科肿瘤的第一位[1,2]。因早期并无特异性症状,故早期诊断困难,发病时约75%患者已处于晚期;其5年内生存率低于30%[3];卵巢癌只生长到1～2mm3,因为没有血管生成而不会发生转移,但在新血管形成后,可呈成数倍增长及转移[4]。间充质干细胞是一种来源于中胚层的多潜能干细胞,其具有低免疫原性、肿瘤趋向性及靶向迁移能力,被广泛应用于多种疾病治疗中[5]。近年来不少研究发现间充质干细胞对卵巢癌有归巢能力,体外实验证明间充质干细胞能够抑制细胞的生长及增殖迁移能力[6,7,8]。但是否能够抑制卵巢癌实体瘤的生长和转移,缺乏相关研究。本实验利用人卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,取贴壁培养法培养经鉴定为人脐带间充质干细胞并将其接种于裸鼠卵巢癌皮下移植瘤,测量肿瘤体积,免疫组化检测VEDF、CD34的表达,研究hUC-MSCs对卵巢癌生长及血管生成相关因子表达的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级,BALB/cNude鼠,雌性,5～6周龄,体重20～22g,购自北京维通利华实验动物公司。饲养于河南省中药研究所。其生长所需的垫料、饲料和饮用水均经高温灭菌处理,使用高效过滤器每小时换气10～15次,相对湿度保持在45%-60%,每日保持10小时的光照及14小时的黑暗环境。

1.2实验细胞

1.2.1SKOV3细胞

购自广州赛业生物科技有限公司,培养于DMEM/F12完全培养基中(即含10%FBS,1%青链霉素的DMEM/F12培养基,5mL培养基/25cm2培养瓶),置于5%CO2、37℃、95%饱和湿度培养箱中培养。每48h换液一次,细胞融合度达80%后进行1∶3传代。

1.2.2hUC-MSCs细胞

由脐带原代培养得来。脐带取自河南省人民医院妇产科健康足月剖腹产的产妇,经产妇及家属书面同意用于科学研究。本实验所用hUC-MSCs细胞为3～5代。

1.3主要试剂与仪器

胎牛血清(Gibco公司,美国);青链霉素双抗(Gibco公司,美国);DMEM/F12培养基(Gibco公司,美国);胰酶(Gibco公司,美国);二抗PV6001(中杉金桥公司,中国);兔抗人VEGF单克隆抗体(Abcam公司,英国);兔抗人CD34多克隆抗体(Abcam公司,英国);巴氏管、15mL离心管、50mL离心管、离心机、光学显微镜等。

1.4方法

1.4.1SKOV3细胞的培养

将SKOV3细胞复苏后培养于含DMEM/F12培养基的无菌培养瓶中。代细胞融合度约80%时,加入1.0mL的0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,显微镜下观察到细胞变圆,细胞开始脱离瓶壁时加入血清终止消化,离心后用生理盐水重悬,并将细胞浓度调制为2×107/mL。

1.4.2hUC-MSCs细胞的培养

将新鲜、无菌的脐带用PBS(含1:1000的青霉素和链霉素)。反复冲洗,去除脐静脉、脐动脉及羊膜,将剩余部分(即华通胶)剪成1mm×1mm×1mm组织块,培养于hUC-MSCs完全培养基中(即含10%FBS的DMEM/F12培养基,5mL培养基/25cm2培养瓶),置于5%CO2、37℃、95%饱和湿度培养箱中培养。每72h换液一次,细胞融合度达80%后进行1:3传代。

1.4.3卵巢癌动物皮下移植瘤动物模型的建立及实验分组

将培养中的处于对数生长的SKOV3细胞经0.25%胰蛋白酶消化后,用0.9%的生理盐水洗涤,调整活细胞浓度为2×107/mL,于裸鼠背部皮下接种0.25mL/只(5×106个细胞/只)。穿刺点距离注射部位1.0cm,每只裸鼠皮下接种1点。次日记为接种第1天,隔日检查皮下肿瘤情况,待所有裸鼠背部肿瘤长径超过0.5cm时开始进行实验。随机抽取荷瘤鼠分为3组,每组5只,分别为正常对照组、实验组1、实验组2。直视下在卵巢癌荷瘤裸鼠背部瘤体内分别注射hUCMSCs1×106和2×106个,每隔1周注射1次,一共注射3次。正常对照组注射生理盐水。

1.4.4观察指标及组织标本的处理

1.4.4.1观察指标

荷瘤裸鼠体重(每隔3天测量一次体重);瘤体积(每隔3天用游标卡尺测量肿瘤结节的长径、短径,根据公式:体积=1/2×长×宽2,记录并计算结节体积,比较各组间瘤体大小的差异)。

1.4.4.2组织标本的处理

注射3次hUCMSCs后继续观察1周后,采用二氧化碳安乐死自动仪,将裸鼠安乐死,连同包膜完整剥离出肿瘤组织。将完整的肿瘤组织用4%的甲醛溶液作常规固定,制备石蜡包埋切片,在制作常规4μm切片,照试剂盒说明书进行HE染色和免疫组织化。并在显微镜下进行图像采集。

1.4.4.3VEGF蛋白表达的计算

镜下每个切片随机选取5个高倍镜视野,判断着色强度,并计算阳性细胞比例。将着色强度分为4个等级,未着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、褐色为3分。按每个视野阳性细胞数所占比例,划分为4个等级:0～5%为0分、5%～25%为1分、25%～50%为2分、50%～100%为3分。每张切片所取视野的得分取其平均值。以两者之积作为最终得分,0～3分定义为低表达,6～9分定义为高表达。

1.4.4.4微血管密度结果判定(MVD)

用CD34标记血管内皮细胞计算微血管数,先用低倍镜(×40)找到肿瘤组织微血管较密集区域,然后在高倍镜(x200)下随机选择5个视野进行计数,其平均值即为微血管密度。

1.5统计学分析

应用GraphPadPrism5统计软件对实验数据进行作图分析,应用SPSS25.0统计分析计量资料,采用平均数±标准差表示,组间比较采用t检验,当P<0.05时差异具有统计学意义。

2、结果

2.1裸鼠成瘤情况

接种后7d左右,在裸鼠背部皮下可见直径约1×2mm大小的结节凸起,质硬,活动度可,周围皮肤无破溃、红肿。成瘤率为100%。荷瘤裸鼠活动、饮食、精神状态等情况与接种前无明显改变。

2.2脐带间充质干细胞对荷瘤裸鼠体的影响

在整个观察期内,对照组与实验中荷瘤裸鼠质量整体稳定;对照组与实验组1、实验组2中的荷瘤裸鼠肿瘤体积整体均呈增长趋势,但对照组肿瘤体积明显大于实验组1体积,而实验组1体积也明显大于实验组2。(表1,图1,P<0.01)

表1各组荷瘤裸鼠移植瘤的体积

图1各组荷瘤裸鼠移植瘤的体积的变化

2.3裸鼠移植瘤的HE染色观察

HE染色后光学显微镜观察对照组及实验组均可见肿瘤细胞丰富、排列密集、细胞异型性明显、核大深染,细胞核质比例明显增大,畸形核和核分裂相多见。细胞内可见大量空泡,少数细胞核固缩、裂解,偶见凋亡细胞。肿瘤组织内有较多坏死组织和炎症细胞浸润,纤维化形成明显。(图2)。

图2HE染色×200

2.4裸鼠移植瘤的免疫组织化学染色观察

2.4.1裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达情况

镜下观察VEGF阳性信号均表达在组织的细胞质中。对照组裸鼠瘤体组织中VEGF的表达量为7.68±0.50,实验组1瘤体组织中VEGF的表达量为5.94±0.86,实验组2瘤体组织中VEGF的表达量为4.44±0.33。实验组VEGF表达量较对照组相比均明显降低,且在一定的浓度范围内随浓度增高而降低,差异具有统计学意义(表2,图3-5,P<0.05)。

2.4.2裸鼠移植瘤组织中CD34的表达情况

CD34蛋白阳性的表达定位血管内皮细胞的细胞质,表现为棕黄色颗粒,用于计算微血管密度。对照组裸鼠瘤体组织中MVD为47.80±6.73,实验组1瘤体组织中MVD为39.32±6.30,实验组2瘤体组织中MVD为28.68±6.05。实验组瘤体微血管密度较对照组相比均明显降低,且在一定的浓度范围内随浓度增高而降低,差异具有统计学意义(表2,图6-8,P<0.05)。

图3对照组VEGF×200

图4实验组1VEGF×200

图5实验组2VEGF×200

图6对照组CD34×200

图7实验组1CD34×200

图8实验组2CD34×200

表1hUC-MSCs作用于荷瘤鼠时肿瘤组织中VEGF、CD34的相对表达量

3、讨论

肿瘤的生长、浸润和转移取决于肿瘤细胞团中血管的新生,肿瘤血管的新生受到许多种活性因子的调控,是肿瘤细胞、血管内皮细胞及微环境相互作用的结果,过程复杂,目前机制尚不能明确[9]。VEGF可增加毛细血管的通透性,从而促进肿瘤细胞进入血管壁并发生转移,其生物活性受癌基因、缺氧、细胞因子及炎性因子等因素调控[10]。MVD测定是研究实体肿瘤间质的血管内皮细胞内表达,但不在肿瘤实质细胞表达,CD34能够高效特异稳定的标记血管内皮细胞[11]。本实验发现于瘤体内注射脐带间充质干细胞与对照组相比,CD34表达量及VEGF表达量明显下降,且当注射细胞量越大时,CD34及VEGF的表达量下降的就越明显。这也与注射脐带间充质干细胞瘤体生长较慢的结果相一致。说明脐带间充质干细胞可能抑制CD34及VEGF的表达来抑制卵巢癌皮下移植瘤的生长。而Otsu等研究发现将间充质干细胞直接注射至皮下黑色素瘤组织内,可诱发细胞凋亡,有效的抗血管生长因子生长,从而抑制肿瘤生长[12]。同时Bexell等研究表明,间充质干细胞可整合到肿瘤组织的血管壁[13]。这些研究也提示我们在瘤体内植入MSC可能会作为一个独特的载体来影响肿瘤血管因子的生成。从而抑制肿瘤的生长。目前,HUC-MSCs其抗肿瘤作用在骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌中均得到验证[14,15]。但本实验中是否通过调节某些信号传导通路而抑制肿瘤的生长从而导致CD34及VEGF的表达降低还是通过直接下调CD34或VEGF的表达来抑制肿瘤的生长还需要来进一步具体探讨。总之,hUC-MSC注射至卵巢癌组织内能引起VEGF及CD34表达下调,可为我们针对抑制卵巢癌微血管生成从而控制肿瘤生长及转移提供了一条新途径。

综上所述,hUC-MSCs可抑制卵巢癌皮下移植瘤的生长,为治疗卵巢癌及减慢进展带来提供了新思路。然而由于本实验选取的干细胞浓度过于局限,更大剂量的脐带间充质干细胞对其作用现尚不明确。而hUC-MSCs对肿瘤的作用机制非常复杂,我们需要进一步探讨间充质干细胞对卵巢癌的作用,为临床应用提供指导依据。

参考文献：

[1]王智文,唐海飞,郑雪松,等.卵巢癌靶向抑制剂的研究进展[J].中国新药杂志,2019,28(20):2492-2497.

[3]王一品,赫东芸,黄琼卫,等.卵巢癌风险预测模型在上皮性卵巢癌早期诊断中的应用价值[J].吉林大学学报(医学版),2019,45(4):905-910.

[4]邱敏,陈俊颖.血管内皮生长因子A与卵巢癌微血管密度及临床病理参数的关系[J].山西医药杂志,2013,42(9):983-985.

[5]张艺凡,胡方方,秦方圆.人脐带间充质干细胞与肿瘤治疗研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2017,31(4):403-406.

[6]袁晓凤,袁修凯,周芳.卵巢癌细胞株SKOV3在人脐带间充质干细胞培养液中的增殖､凋亡和迁移情况观察[J].山东医药,2018(11):46-49.

[9]徐晓卿,张盈盈,齐元富.血管内皮细胞与恶性肿瘤关系的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2018,23(2):180-184.

[10]朱亚芳.川芎嗪联合顺铂对小鼠Lewis肺癌生长及90K､Arresten､VEGF的影响[D].河北北方学院,2016.

[11]赵慧巧,卢年华,张旭东,等.结肠癌微环境对HMSC-bm形态､增殖､周期及CD34､CD90的影响[J].中国细胞生物学学报,2018(5).

卢晓莉,刘广芝,秦方圆,成乐楠,赵子仪,葛利葱,翟亚萍,杨秋云.人脐带间充质干细胞对人卵巢癌皮下移植瘤生长及CD34和VEGF表达的影响[J].医药论坛杂志,2020,41(03):37-41.

基金:河南省基础与前沿技术研究计划(162300410096)