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基于GEO数据库挖掘PE患者外周血潜在标志物及可能机制

2020-08-08 437 上传者：管理员

摘要：目的基于GEO数据库挖掘先兆子痫(PE)患者外周血潜在标志物及可能机制。方法从GEO数据库中收集PE人群研究的外周血mRNA基因芯片GSE48424，共计36例，并根据是否发生PE将其分为两组，即PE组和对照组。在GEO2R平台内对各组的数据进行差异mRNA基因分析，剔除|Log2 Fold Change|<1、修正P值>0. 05以及信息不完整的基因数据，将筛选出的差异基因导入String在线数据库完成基因本体(GO)富集分析，并获得差异基因所编码的蛋白质之间的相互作用。结果筛选出差异基因65个，其中Toll样受体4 (TLR4)和GTP环化水解酶1 (GCH1)是处于网络核心的蛋白。差异基因主要参与的生物学过程包括对脂多糖的反应、对肿瘤坏死因子的反应、转化生长因子β生成的积极调节、Toll样受体信号通路的正调节和烟酰胺代谢过程;主要富集的细胞组分是神经元投射、突触小泡、高尔基体、质膜的整体成分和内质网;主要发挥的分子功能包括受体活性和蛋白质结合。结论 PE的发生可能与对脂多糖的受体活性调节有关，TLR4和GCH1可作为外周血中的潜在标志物。

关键词：
GEO数据库
GTP环化水解酶1
Toll样受体4
先兆子痫
妊娠期
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先兆子痫(PE)是妊娠期特有的一种系统性疾病，以高血压和蛋白尿为主要特征，并可导致多器官损害，从而增加母体和胎儿的死亡风险，发病率为3%～14%[1]。但是目前尚无针对PE的特异性早期检验方法，仅可通过临床检验发现新发高血压伴蛋白尿确诊并区分PE严重程度。因此，寻找一种可靠的生物标志，对于早期诊断及预防具有重要意义[2]。基因表达综合数据库(GEO)是美国国立生物技术信息中心旗下的一个基因表达公共数据库，共享的基因组数据为疾病诊断、治疗及机制研究提供了有效的参考[3]。本研究拟通过GEO数据库，对PE患者外周血中差异表达的基因进行挖掘，从而寻找潜在的提示PE的生物标志物及PE可能的发病机制，从而为PE的早期诊断及预防提供一定的参考。

1、对象与方法

1.1研究对象

从GEO数据库中下载PE人群研究的外周血mRNA基因芯片GSE48424(36 samples)数据，并根据是否发生PE将其分为两组，即PE组和对照组。

1.2方法

1.2.1差异基因选取

在GEO2R平台内(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)，对两组的mR-NA数据进行差异性分析，按自动设计方案分析后，选出表达差异明显的基因[4]，剔除|Log2 Fold Change|<1、修正P值>0.05以及信息不完整的基因数据。

1.2.2蛋白相互作用网络的构建

将筛选出的差异基因导入String在线数据库(http://fahf7788960734bd4438a77977bb57dc437bhoxcppq6kwou66v5x.fyay.oca.swupl.edu.cn/)，获得差异基因所编码的蛋白质之间的相互作用，并进行聚类分析，从而找出处于网络核心的关键蛋白。

1.2.3差异基因的基因本体富集分析

使用生物信息学在线分析工具DAVID(http://fahf38292ef698674c54b982139d02a2df0asoxcppq6kwou66v5x.fyay.oca.swupl.edu.cn/)对筛选出的共同差异基因进行生物学注释和分类[5]，完成基因本体(GO)富集分析。

2、结果

2.1差异基因选取结果

从共计30 742个基因中，筛选出65个复合条件的差异表达基因。

2.2蛋白相互作用网络

差异基因编码蛋白之间相互作用的网络见图1。其中Toll样受体4(TLR4)和GTP环化水解酶1(GCH1)是处于网络核心的蛋白。

图1差异基因编码蛋白相互作用网络

2.3 GO富集分析

GO富集分析分为生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面，按基因富集指数差异基因主要参与的生物学过程依次是对脂多糖的反应、对肿瘤坏死因子的反应、转化生长因子β生成的积极调节、Toll样受体信号通路的正调节和烟酰胺代谢过程;主要富集的细胞组分依次是神经元投射、突触小泡、高尔基体、质膜的整体成分和内质网;主要发挥的分子功能依次是受体活性和蛋白质结合。

3、讨论

PE是指孕妇妊娠20周以后出现的血压升高和蛋白尿，并伴有头痛、呕吐、上腹不适等症状，其中重度先兆子痫也是导致孕妇及围产儿死亡的重要原因之一。PE不仅会给产妇和胎儿带来严重后果，还会给社会带来沉重负担，世界卫生组织开展的一项分析评估了2003-2009年期间产妇死亡的原因，高血压原因排在第二位，占14%[6]。目前PE发病机制尚未完全明确，缺乏有效的预防措施，常在孕期中出现症状后进行对症治疗[7]。因此，若能寻找到一种便捷、可靠的生物标志并进一步探索PE发病机制，从而早期识别PE高危孕妇并采取相应预防措施，将有利于改善母婴结局。

GEO数据库隶属美国国立卫生研究院生物技术信息中心，是目前最大最全面的基因表达数据公共资源，其要求各研究机构在提交论文的同时，也要提交高通量基因检测的原始数据，即目前已经发表论文之中所涉及的基因检测数据，绝大多数均可通过GEO数据库获得，这也为PE的基因水平研究提供了新的研究途径和研究手段[8,9]。

本研究发现，在PE患者的外周血中，TLR4表达水平与对照组比较差异较大，且其处于蛋白网络核心处，提示TLR4可能与PE的形成有关。TLR4是模式识别受体家族，可识别外源性配体以及热休克蛋白等高迁移率族蛋白1内源性配体，导致NF-κB活化，细胞因子分泌和炎症反应，还可参与由游离脂肪酸触发的非依赖性炎症反应，与特异性免疫、免疫耐受等密切相关[10]。邓棋芳等[11]通过对47例早发型重度先兆子痫患者的研究发现，其血清和胎盘组织中TLR4的表达水平均明显升高，表明TLR4可能参与了早发型重度先兆子痫的发病，吕连峥等[1]研究发现，PE患者外周血单核细胞的TLR4表达显著增加，且处在活化状态，同时分泌了较多的促炎因子IL-6和TNF-α，表明TLR4可能是时PE的标志物之一，同时也是潜在的治疗靶点。本研究还发现GCH1同样处在蛋白网络的核心位置，GCH1能够催化GTP转化为7,8-二氢蝶呤三磷酸，是四氢生物蝶呤在生物合成中的首要限速酶，在调节脐静脉内皮细胞一氧化氮合成过程中发挥重要作用[12]。有研究[13]表明，抑制GCH1/四氢生物蝶呤通路可通过调节凝血酶敏感蛋白1及可溶性鸟苷酸环化酶系统调节高血压患者内皮祖细胞的活性及再内皮化功能。有文献证实妊娠期间弥散性内皮细胞损伤是先兆子痫发病的重要机制[14]，血管内皮功能的下降可导致血管内膜的完整性受到破坏，亦可致使胎盘着床较浅，胎盘血管生成降低，绒毛供血供氧不足，促进子痫的发生。

本研究通过对差异基因进行GO富集分析以进一步探索相关机制，结果提示，差异基因主要定位于细胞核外，主要发挥的分子功能包括受体活性和蛋白质结合，这与TLR4的功能类似，从而也验证了蛋白质相互作用网络分析的结果。主要参与的生物学过程包括对脂多糖的反应、对肿瘤坏死因子、转化生长因子β生成的调节。其中脂多糖是一种来源于革兰阴性细菌细胞壁的毒素，是TLR4的主要配体，在感染发生时脂多糖可进入机体，造成天然免疫细胞，如单核巨噬细胞合成并释放大量的炎症因子[15]。而且动物实验也证实，应用脂多糖可以制备先兆子痫大鼠模型[16]。也有研究发现脂多糖可作用于滋养细胞，并诱导一些细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10、白细胞介素-6等，促使先兆子痫的发生[17]。

综上所述，TLR4和GCH1可能与PE的发生有关，本实验为PE的进一步研究提供了一定的参考。

参考文献：

[1]吕连峥,蔺昕,钱雷,等.子痫前期患者外周血单核细胞Toll样受体4检测及其意义[J].现代生物医学进展,2015,15(35):6952-6955,6973.

[2]程颖,周树民.先兆子痫生物标志物的研究进展[J].医学综述,2018,24(11):2114-2118.

[3]张新春,郑景辉,莫云秋,等.基于GEO数据库芯片的早期ST段抬高性心肌梗死标志物的筛选及生物信息学分析[J].当代医学,2018,24(12):1-6.

[7]王链链,杜鹃.子痫前期的高危因素及预测指标的研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2018,32(11):1129-1131.

[10]徐鑫,程蔚蔚. Toll样受体在子痫前期中的研究进展[J].中国妇产科临床杂志,2016,17(3):276-278.

[11]邓棋芳,周瑞,王霞,等. Toll样受体在早发型重度子痫前期患者外周血和胎盘组织中的表达及临床意义[J].海南医学,2017,28(22):3642-3644.

[13]姚顺,吴少虹,柏勇平,等. GTP环化水解酶Ⅰ/四氢生物蝶呤通路对高血压内皮祖细胞体外活性和体内再内皮化能力的调节[J].中国动脉硬化杂志,2018,26(3):265-272.

[15]李思扬.脂多糖调节细胞因子在细胞滋养细胞的表达及其与子痫前期的关系[M].中国医科大学,2007:17-18.

[16]黄玲玲,李静,唐卉.硫酸镁对先兆子痫大鼠病理模型子代海马神经细胞的保护作用[J].中华妇幼临床医学杂志(电子版),2015,11(1):31-36.

[17]黄艳君,王晓,姜健慧,等.脂氧素A4对脂多糖诱导的人滋养细胞炎症细胞因子的影响[J].中华医院感染学杂志,2016,26(23):5395-5397.