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稽留流产绒毛组织染色体检测中高通量测序技术的应用研究

2020-08-08 738 上传者：管理员

摘要：目的通过高通量测序技术检测稽留流产绒毛染色体，包括非整倍体改变及拷贝数变异，分析染色体异常与稽留流产的相关性。方法稽留流产的患者63例，无菌条件下留取绒毛组织，应用高通量测序技术对绒毛染色体进行检测，并对结果进行分析。结果 63例绒毛组织均检测成功，63例样本中染色体异常45例（异常率71%），其中非整倍体改变为32例（异常率51%），拷贝数变异共检出13例（异常率21%）。结论稽留流产的主要病因是染色体异常。高通量测序技术检测绒毛染色体异常具有一定的优势及临床意义。

关键词：
基因
流产
稽留
非整倍体
高通量测序
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稽留流产又称过期流产，主要表现为胚胎停止发育且未能及时自然排出者[1]。稽留流产的发生与胚胎发育、母体及环境等因素有关。有研究表明，胚胎或胎儿的染色体异常是其最常见的原因，约占50%～60%[2]。由于绒毛组织由胚外中胚层细胞和滋养层细胞组成，因此它具有与胎儿相同的遗传特性。因此发生稽留流产时，绒毛组织的染色体检测对本次流产病因的诊断及以后的生育指导均有重要意义[3]。本研究采用高通量测序技术，对既往63例稽留流产的绒毛组织进行染色体检测，明确稽留流产的遗传学因素。

1、资料与方法

1.1研究对象

选择2018年7月至2019年4月于山西省妇幼保健院妇产保健综合门诊诊断的63例稽留流产患者，经患者知情同意后纳入研究，本组患者年龄为21～40岁，孕周6～12周。诊断标准：有停经史，无或少量阴道流血；血绒毛膜促性腺激素高于正常；超声检查宫腔内有空孕囊或可见胚芽，未见心管搏动。

1.2方法

1.2.1取材：

确定稽留流产后，向患者交待病情，签署同意书后于无菌操作下行清宫术，术后选取不带血丝、颜色为透亮的白色或乳白色生长状态良好的绒毛组织约5～10g，用0.9%氯化钠注射液反复冲洗后送检。

1.2.2高通量测序技术检测步骤：

(1)将无菌条件下提取的基因组DNA打成小片段核酸；(2)构建DNA片段文库，并进行上机测序，测序仪器为NextSeqCN500高通量测序仪；(3)通过RUPA软件将测序结果进行比对分析，判断染色体片段是否存在异常。

1.2.3绒毛染色体结果判定：

通过检索基因变异数据库（DGV）、人类染色体变异数据库（DECIPHER）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）等公共数据库，对检测结果进行分析。

2、结果

2.1稽留流产绒毛组织染色体检测结果：

63例稽留流产绒毛组织均检测成功，阴性18例（29%），阳性45例（71%），其中染色体非整倍体共32例（51%），染色体拷贝数变异共13例（21%）。

2.2染色体非整倍体检出情况：

染色体非整倍体检出32例：其中16号三体11例；X染色体单体、13号三体、14号三体、15号三体各2例；2号三体、3号三体、4号三体、8号三体、9号三体、10号三体、12号三体、18号三体、22号三体各1例；3例69,XNN;1例68,XN。见表1。

表1稽留流产绒毛组织染色体非整倍体检测结果

2.3染色体拷贝数变异检出情况：

染色体拷贝数变异检出13例，查询公共数据库，其中6例注释为各类微缺失微重复综合征；5例注释为致病性未知，1例注释为可能致病，1例注释为多态性。见表2、表3。

3、讨论

3.1稽留流产的主要病因是染色体异常：

近年来稽留流产的发病率逐渐升高，给孕妇及家庭带来了身体和精神上的双重痛苦。因此，需要探讨流产病因并科学指导再次受孕。稽留流产的原因包括遗传、感染、免疫、解剖、环境等多种因素，有研究显示染色体异常为稽留流产的主要原因[4,5]。本研究中63例标本均成功检测，检出染色体异常的为45例，异常率为71%，也说明了稽留流产的主要病因是胚胎染色体异常，与既往文献报道相一致。

稽留流产染色体异常包括数目和结构异常，数目异常较多见，这可能是由于数目异常的胚胎遗传缺陷大、致死性高。在数目异常的染色体核型中，又以非整倍体改变较常见[6]，非整倍体中以三体较为常见。研究表明[7,8]，在常染色体中，以16号三体异常多见，可能是由于16号染色体随体变化程度较高。本研究中检出16号三体数量最多，共11例，其发生率占非整倍体改变的34%。63例稽留流产绒毛组织中染色体非整倍体32例（51%），染色体拷贝数变异共13例（21%），说明非整倍体改变仍然是稽留流产常见的染色体异常类型。

3.2高通量测序技术的优势及临床意义：

传统的染色体G显带核型分析不仅能检测（5～10)Mb以上的染色体片段异常，还能检测染色体结构异常，并且其成本较低，在临床应用广泛，被认为是染色体检测的金标准。但是绒毛样本应用此检测方法存在一些弊端，如绒毛组织易被污染导致培养失败、耗时过长、对实验室人员要求高等。同时有研究表明，染色体核型分析中被认为核型正常的细胞中还存在亚显微水平的缺失、重复等拷贝数变异[9]。拷贝数变异是DNA片段超过1kb的增加或减少，包括基因位点的缺失、插入和重复等。一旦拷贝数变异涉及与生长发育相关的重要基因片段的缺失和重复，最终可能导致胎儿死亡和流产[10,11]。如果仅对稽留流产的绒毛组织进行常规染色体核型分析容易漏诊染色体微缺失、微重复。另外，荧光原位杂交技术（FISH）也可以用于绒毛组织的检测[12]，该技术不仅耗时短，且对技术人员要求较低，但是它只可检测出13,16,18,21,22,X和Y这7条染色体异常，而无法对整个染色体组进行分析。作为以第二代测序为代表的高通量测序技术[13,14]，不仅能检测46条染色体非整倍体异常，还能检测出100kb以上片段的微缺失、微重复，而且有对绒毛样本要求低、检测率高、出具报告时间短、成本低于基因芯片等优点。高通量测序技术的最大优势在于可以发现不同区域的拷贝数变异，该技术可以弥补染色体核型分析和FISH技术的不足，可以作为传统染色体核型分析的补充方法。本研究中染色体拷贝数变异13例（检出率21%），由此可见，对绒毛组织进行拷贝数变异分析可提高异常检出率，从而更好地进行遗传学分析。

表2稽留流产绒毛组织染色体拷贝数变异检测结果

表3稽留流产绒毛组织染色体拷贝数变异检测结果

综上，稽留流产的主要病因是染色体异常。对绒毛组织进行染色体检测可帮助临床医师更有效的寻找稽留流产的病因，与传统染色体核型分析和FISH技术相比，高通量测序技术具有更高的检测深度和准确度，它能发现更多的染色体异常，可为下次妊娠提供更有价值的临床建议和遗传指导。对胚胎染色体异常的父母，可通过父母外周血染色体检查从而判断染色体异常为新发突变还是遗传于父母，下次妊娠可进行遗传咨询及产前诊断，从而提高妊娠质量。

参考文献：

[1]谢幸,孔北华,段涛.妇产科学[M].9版.北京:人民卫生出版社,2018:36.

[4]方小武,李红艳,干志峰,等.绒毛染色体培养和荧光原位杂交技术应用于自然流产原因分析[J].中国优生与遗传杂志,2012,20(4):57.

[5]王玮,李海波,刘敏娟,等.比较MLPA与细胞遗传学技术在流产绒毛染色体分析中的应用[J/CD].中国产前诊断杂志(电子版),2014,6(1):5-8.

[6]倪蓉,梁健,邱峰龙,等.胚胎停育160对夫妇的染色体核型分析[J].中国临床研究,2017,30(2):242-244.

[7]刘海波,王慧慧,郑育红,等.229例流产绒毛染色体核型分析及两种长期培养方法比较[J].现代生物医学进展,2014,14(28):5410-5413.

[11]李婵.NGS技术检测稽留流产绒毛染色体非整倍体及拷贝数变异的研究[D].银川:宁夏医科大学,2017.

[12]周佳,蔡彩萍,姚红霞,等.FISH技术在检测自然流产绒毛组织非整倍体异常中的应用研究[J].生殖与避孕,2013,33(5):351-353.

李奉瑾,姚欣雨,张玉萍.高通量测序技术在稽留流产绒毛组织染色体检测中的应用分析[J].中国药物与临床,2020,20(03):348-350.