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褪黑素提高二苯酮-3暴露小鼠早期胚胎体外发育潜能的研究

2024-04-03 9 上传者：管理员

摘要：目的探究褪黑素（MT）在二苯酮-3(BP-3)暴露小鼠早期胚胎体外发育中的保护作用。方法将小鼠合子期受精卵分别在KSOM培养液（对照组）、0.8μmol/L BP-3培养液（BP-3组）以及1×10-7 mol/L MT+0.8μmol/L BP-3混合培养液（MT组）中进行培养。通过检测三组胚胎的囊胚率、基因转录水平、蛋白表达水平，以及DNA损伤程度来探讨MT对BP-3暴露小鼠早期胚胎体外发育潜能的挽救作用。结果 MT提高了BP-3暴露小鼠胚胎体外发育潜能。与对照组相比，MT处理显著提高了BP-3组胚胎ATP5A和ATP5B的蛋白表达，降低了DNA损伤（P <0.05）。此外，抗氧化基因Gpx1及多能性相关基因Pou5f1、Cdx2的转录水平在MT组囊胚中出现了明显上调、促凋亡基因Bax表达下降。与对照组相比，BP-3处理增强了囊胚中γ-H2AX信号强度（P <0.05），而添加MT可以有效缓解DSBs(P <0.05)。结论生理浓度BP-3暴露具有生殖毒性，但添加适当浓度的MT可明显改善BP-3暴露小鼠早期胚胎的体外发育潜能及其质量。

关键词：
BP-3
二苯酮-3
体外发育潜能
胚胎质量
褪黑素
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根据世界卫生组织的预测，不孕不育症是仅次于肿瘤和心脑血管疾病的人类第三大疾病[1]，而日益严重的环境污染是造成生育能力下降的重要因素之一[2]。二苯酮-3(benzophenone-3,BP-3）是防晒霜中一种常用的紫外线保护剂，随着人们防晒意识的重视，其应用日益增多。研究发现[3],BP-3不仅存在于自然环境中，也存在于人类体液中，已然成为一种常见的环境污染物。BP-3暴露与精子、前列腺、婴幼儿神经系统的发育有重要关联[4,5]。此外，近期研究[6]证明生理浓度范围内（0.8μmol/L）的BP-3暴露通过加剧氧化应激、促进细胞凋亡来降低小鼠卵母细胞的体外成熟水平，但其对早期胚胎发育的危害和具体机制尚不清楚。因此，本研究针对常用防晒霜中可能存在影响女性胚胎发育潜能的BP-3以及如何挽救此生殖危害而作了进一步研究。此外，褪黑激素（melatonin,MT）是由松果体产生的一种胺类激素，在机体内有着广泛的生理功能，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等，对生殖系统有着重要的调节作用[7,8,9,10]。迄今，许多研究已经证实MT可通过抑制氧化应激、维持卵母细胞膜的通透性、改善胚胎的冻存效果等方面来促进卵泡成熟及提高胚胎发育潜能，进而提高辅助生殖技术（ART）的成功率[11,12,13,14,15]。尽管如此，MT是否可逆转BP-3暴露对早期胚胎的不利影响仍尚未明晰，且相关研究有限。因此，本研究拟阐明MT可通过促进ATP生成、降低DNA损伤、下调氧化基因，以及抗凋亡等方式，从而改善BP-3对早期胚胎发育的不利作用，旨在理解早期胚胎发育的调控机制以及为临床上因环境因素导致胚胎质量下降的患者提供新的诊疗策略。

1、材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

ICR品系7～10周龄的雌性小鼠及9～12周龄的雄性小鼠。所有SPF小鼠均购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，在水云天动物实验中心进行饲养繁殖，且所有实验均获得水云天伦理委员会批准，伦理批件号：SYT2023107。

1.1.2主要试剂和仪器

血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）购自宁波第二激素厂，MT、M2培养液、KSOM培养液购自美国Sigma公司，BP-3购自Selleck Chemicals公司，DNA试剂盒购自Qiagen公司，γ-H2AX购于CST公司，ATP5A、ATP5B购于Santa Cruz Biotechnology公司，二抗均购于Abcam公司。主要仪器包括实时荧光定量PCR仪Quantstudio 3、Champ Chemi 910全自动发光仪、Nikon倒置荧光显微镜和A1R激光共聚焦显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠胚胎的体外培养（IVC)

雌鼠于16:00腹腔注射10 IU PMSG，间隔48 h再注射10 IU HCG进行超数排卵，随后与雄鼠1∶1合笼，第二天早晨检出含阴道栓小鼠。收集受精卵，经透明质酸酶去除颗粒细胞，在M2培养液中清洗3遍，将胚胎移入IVC培养液，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养，观察并记录胚胎体外发育情况。

1.2.2 胚胎的实验处理

将BP-3和MT各予DMSO溶解，分别使其浓度为10 mmol/L和0.1 mol/L。取KSOM培养液将BP-3浓度稀释成0.8μmol/L，以下简称BP-3培养液。取0.8μmol/L BP-3培养液将MT稀释，使最终浓度为1×10-5 mol/L、1×10-7 mol/L、1×10-9 mol/L，以下简称MT培养液。将采集的小鼠合子期受精卵，分别放入KSOM培养液（对照组）、BP-3培养液（BP-3组）和MT培养液（MT组）中进行IVC。

1.2.3 q RT-PCR检测m RNA表达

按照RNeasy Mini Kit试剂盒配置好反应体系，对囊胚基因组进行提取。引物序列如下：GAPDH：正向5'-AGGTC-GGTGTGAACGGATTTG-3'，反向5'-TGTAGACCAT-GTAGTTGAGGTCA-3';Bax：正向5'-TTTGCTTCAG-GGTTTCATCC-3'，反向5'-ATCCTCTGCAGCTCCA-TGTT-3';Gpx1：正向5'-CCAGGAGAATGGCAAGA-ATGAA-3′，反向5'-AGGAAGGTAAAGAGCGGGT-GAG-3';Cdx2：正向5'-CAAGGACGTGAGCATGTA-TCC-3'，反向5'-GTAACCACCGTAGTCCGGGTA-3';Pou5f1：正向5'-CGGAAGAGAAAGCGAACTAGC-3'，反向5'-ATTGGCGATGTGAGTGATCTG-3'。基于2-ΔΔCt，算出目的基因相对表达量。

1.2.4 Western blot分析

囊胚予PBS洗涤3次后裂解在含有蛋白酶抑制剂的Laemmli sample buffer中，煮沸5 min。样品在10%SDS-PAGE凝胶上电泳，待分离后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，随后与一抗ATP5A(1∶200）、ATP5B(1∶200）和GAPDH(1∶1 000）结合，4℃孵育过夜。第2天PBST清洗3次，再加入二抗羊抗兔Ig G(1∶3 000）、羊抗鼠Ig G(1∶3 000）室温孵育1 h，随后用发光试剂盒来检测蛋白。Image J软件对蛋白条带结果进行分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.2.5 囊胚DNA损伤的测定

将囊胚置于4%PFA固定30 min,1%Triton通透30 min,0.5%BSA室温封闭2 h，加入一抗γ-H2AX(1∶400)4℃孵育过夜，PBS清洗3次，加入二抗室温孵育1 h，再放入DAPI孵育5 min，予PBS清洗3次，压片后用共聚焦显微镜观察结果。

1.3 统计学方法

采用Graph Pad Prism 9.0进行数据分析。计量数据均以均数±标准差表示，通过方差分析对多组间进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 MT提高了BP-3暴露小鼠胚胎体外发育潜能

IVC结果显示，0.8μmol/L BP-3处理后的囊胚率显著低于对照组，而补充不同浓度MT(1×10-5mol/L、1×10-7 mol/L和1×10-9 mol/L）均能有效提高BP-3暴露胚胎的发育能力，其中以1×10-7 mol/L MT的挽救效果最为显著（P<0.05，图1A、表1），因此本实验采用的MT处理浓度为1×10-7 mol/L。此外，对照组、BP-3组及MT组间的2细胞率和囊胚细胞核数目差异无统计学意义（P>0.05，图1B、表1）。

图1 MT促进BP-3暴露小鼠早期胚胎体外发育水平

表1 MT对BP-3暴露小鼠胚胎体外发育潜力的影响

2.2 囊胚中Gpx1、Bax、Cdx2、Pou5f1基因的转录水平

q RT-PCR结果显示，MT组囊胚的Gpx1的转录水平是BP-3组的3倍（P<0.05，图2A),Bax的表达水平相对BP-3组约减少了一半（P<0.05，图2B）。此外，与对照组相比，BP-3处理后抑制了囊胚的Pou5f1和Cdx2基因转录，但加入MT后可恢复到了正常水平（P<0.05，图2C、D）。

2.3 囊胚中ATP5A、ATP5B的蛋白表达水平

Western blot结果显示，与对照组相比，BP-3组中ATP5A、ATP5B的表达水平均明显下调（P<0.05），而添加MT后ATP5B蛋白恢复至正常表达水平，但ATP5A的表达仍低于对照组（P<0.05，图3）。

2.4 MT对BP-3暴露小鼠胚胎DNA损伤的影响

通过免疫荧光方法检测DNA损伤情况，结果如图4所示，与对照组相比，BP-3处理增强了囊胚之中γ-H2AX信号强度（P<0.05），而添加MT可以有效缓解DSBs(P<0.05）。

图2 囊胚中氧化应激、凋亡以及多能性相关基因的转录表达水平

图3 MT提高BP-3暴露小鼠囊胚的ATP5A、ATP5B蛋白水平

3、讨论

大量动物试验[4,16]指出BP-3对生殖系统会产生毒性。本文的研究结果也表明了它对体外培养的小鼠胚胎同样具有胚胎毒性，引起早期胚胎生长发育迟缓和异常。MT由于有着强大的神经内分泌免疫调节活性和清除自由基抗氧化能力，近年来被广泛研究于ART、动物遗传育种与繁殖等方面。据报道[12,17,18],MT可以有效改善人、猪、牛及小鼠等哺乳动物卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育质量。为了进一步证实MT对因环境因素引起的胚胎损伤亦有显著的保护作用，我们将0.8μmol/L BP-3暴露小鼠胚胎在1×10-7mol/L MT的培养液中进行IVC来检测三组囊胚率差异情况。结果发现，经MT处理后体外囊胚形成率达到了79.34%，约是BP-3组的两倍。这提示MT对BP-3损害的胚胎发育发挥着保护作用，该结果与之前的报道[6,12,17,19]相一致。

BP-3处理的胚胎，显示出Gpx1下调、Bax上调，ATP5A和ATP5B的抑制，γ-H2AX的荧光信号增强，均表明了BP-3引起氧化应激加剧，细胞结构破坏，线粒体损伤，最终诱导了大量胚胎凋亡。既往相关研究结果均表明，MT添加在哺乳动物卵母细胞培养液中，可通过降低ROS、增加GSH和线粒体膜电位来显著降低氧化应激水平，从而提高卵子成熟率和囊胚率[19,20,21]。CUI等[17]通过在猪胚胎的IVC中添加鱼藤酮和MT，结果发现MT通过激活SIRT1/PGC-1α途径，增加了线粒体生物发生和ATP含量来抑制囊胚细胞的凋亡。本研究也得到相似的结果，MT可恢复BP-3暴露小鼠胚胎Gpx1、Bax、ATP5A、ATP5B及γ-H2AX的正常表达水平，其机制可能是MT通过增加线粒体生物发生来挽救因环境毒素引起的胚胎氧化应激加剧和能量不足情况，从而提高胚胎细胞的活力。

图4 MT恢复BP-3暴露小鼠囊胚的DNA损伤程度

Pou5f1和Cdx2是胚胎分化和发育相关基因的启动子，虽然在8细胞期时这两种基因都有表达，但在囊胚晚期时两者呈现相互抑制的表达模式，即Pou5f1在囊胚腔形成后仅在ICM中高表达[22]；而Cdx2局限表达于TE，成为滋胚层的标志因子[23,24]。HUAN等[25]的研究中发现，MT处理镰刀菌素B1(EB1）暴露的胚胎后，能明显改善EB1囊胚中的Pou5f1和Cdx2的DNA去甲基化不完全，增加细胞的ATP能量水平，从而恢复Pou5f1、Cdx2的表达水平。本研究结果显示MT组Pou5f1和Cdx2的基因表达量显著高于BP-3组，且与对照组无明显差异，得到了与HUAN等研究相似的结论。这说明MT在早期胚胎IVC中对BP-3降低小鼠囊胚中多能性相关基因转录水平有着明显的改善作用，其机制可能是通过影响细胞能量代谢及DNA甲基化重编程水平来维持早期胚胎发育的TE和ICM细胞命运分化，从而促进优质囊胚的形成。

本研究尚有不足之处：首先，需结合体内实验验证MT对BP-3暴露小鼠胚胎发育潜能是否同样存在改善作用。其次，本实验具体的分子机制还不完善，如氧化应激、线粒体功能、表观遗传等。最后，在后续的研究中拟结合临床废弃样本如三原核受精卵，以全面评估BP-3暴露对人类胚胎发育的危害。

综上所述，MT可以通过改善BP-3暴露引起的早期胚胎氧化还原失衡、多能性下降、ATP缺乏和细胞凋亡等情况，进而显著提高小鼠胚胎体外发育能力及质量。因此，本研究阐明了BP-3暴露通过破坏胞内氧化还原平衡致小鼠早期胚胎发育异常的分子机理及MT的挽救作用，为环境因素引起生育困难患者的临床诊疗提供了理论依据，具有重要的潜在临床应用价值。

参考文献:

[6]尹锦雯,朱海瑛,肖国宏.生理浓度二苯酮-3暴露对小鼠卵母细胞体外成熟及其质量的影响[J].实用医学杂志,2022, 38(9):1051-1055.

[10]潘红梅,臧胜芹,张亮,等.外源性褪黑素促进哺乳动物卵母细胞成熟的研究进展[J/OL].中国畜牧杂志,2021, 57(12):25-30.

[24]赵楠楠,王艳,郭艳娟,等. Oct4和Cdx2对牛胚胎内细胞团和滋养外胚层分化的影响[J].中国实验动物学报,2020, 28(6):818-823.

基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(编号:82101733);广州市科技计划项目(编号:2023A04J0543);

文章来源:熊钰莹,史若锦,朱海瑛,等.褪黑素提高二苯酮-3暴露小鼠早期胚胎体外发育潜能的研究[J].实用医学杂志,2024,40(07):904-909.