1、引言

2019年底暴发的新型冠状病毒肺炎在随后几个月内迅速演变成全球性的突发公共卫生事件,截至2020年8月26日已有超过2375万余人确诊感染新型冠状病毒,死亡人数超过81万[1].目前治疗COVID-19以支持疗法为主,尚没有特效药,亟需发展有针对性的抗病毒药物.

冠状病毒(coronavirus,CoV)是一类有包膜的正链RNA病毒,属套病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus),外形如皇冠而得名,可以感染禽类及多种哺乳动物.病毒在不同宿主上的重组变异产生新型冠状病毒,隔若干年在人群中暴发一次[2],如2002/2003年的非典型性肺炎(又称严重急性呼吸综合症)、2012年的中东呼吸综合症以及COVID-19,都是由冠状病毒引起重大疫情的典型代表[3],病原体分别为SARS-CoV[4,5,6]、MERS-CoV[7]和SARS-CoV-2[8,9,10,11].

在分类学上,冠状病毒包括4个属:α(第1组)、β(第2组)、γ(第3组)和δ(第4组).每个属根据进化关系又被分为不同谱系.SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2同属于β家族[12].β家族又包括a、b、c和d四个谱系,SARS-CoV和SARS-CoV-2属于b系(即2b),MERS-CoV属于c系(即2c).与其他人类冠状病毒如HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1等感染引起的轻度自限性上呼吸道感染症状不同,SARS、MERS和COVID-19患者除有严重的急性呼吸道疾病外,重症病人会伴有多器官衰竭,对人类健康和社会经济产生深远影响.

冠状病毒基因组全长27～32kb,是迄今知道的最大RNA病毒[13,14].其基因组均具有相同的组织和表达方式,从5′到3′依次为:复制酶、棘突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelop,E)、膜蛋白(membrane,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)和一些辅助蛋白.其中,复制酶是非结构蛋白,由两个多聚蛋白(polyprotein)pp1a和pp1ab组成,是参与病毒复制周期的多种因子的前体,需要被病毒自身编码的蛋白酶水解释放才能发挥功能.负责水解多聚蛋白的酶有两类,都来自于多聚蛋白中的结构域.第一类为类木瓜蛋白酶(papain-likeprotease,PLpro),负责水解多聚蛋白N端的少数几个位点,类木瓜蛋白酶在不同类型冠状病毒中有较显著的差别;第二类为3CL蛋白酶(3C-likeprotease,3CLpro),负责水解多聚蛋白C端的大部分位点,也被称为主蛋白酶(mainprotease,Mpro).本文围绕SARS-CoV、MERS-CoV和SARSCoV-23CL蛋白酶的结构与功能关系、已报道抑制剂的结构类型与活性及可能的作用机制进行归纳总结,并探讨了3CL蛋白酶抑制剂研发的新方向.

2、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-23CL蛋白酶结构与功能研究进展

SARS是人类进入21世纪以来第一个公共传染疾病,暴发后全球科学家迅速展开了针对性研究,包括基因组测序、生物信息学分析、应急性的临床用药或进入临床化合物筛选、疫苗研究、药物设计等.抗SARS经验和针对SARS-CoV的相关研究为抗MERS-CoV和SARS-CoV-2打下了很好的基础.

序列比对显示,SARS-CoV-2和SARS-CoV3CL蛋白酶有约96%的序列相似性,与MERS-CoV3CL蛋白酶有约50%的相似性[15].3CL蛋白酶负责水解病毒多聚蛋白C端的大部分位点[14,15],对多聚蛋白的成熟起主要作用,是病毒复制繁殖的关键酶.它们在冠状病毒中高度保守,是抗冠状病毒疾病的重要药物设计靶点[16].对该酶的结构与调控机制研究是寻找针对3CL蛋白酶为靶标的抗冠状病毒药物的基础,也为深入理解蛋白质在生命活动中的多样性和重要性提供了线索.

2.13CL蛋白酶结构与功能

已报道的冠状病毒3CL蛋白酶晶体结构均为同源二聚体,构成二聚体的亚基包含三个结构域[16,17,18,19,20,21,22,23](图1).N端为类似胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin-fold)结构的两个β折叠结构域(I和II)形成的催化结构域,由半胱氨酸和组氨酸构成的催化二联体位于结构域I和II形成的裂隙中;C端为一个由5个α-螺旋形成的结构域III,又被称作螺旋结构域或C结构域,通过柔性环状结构(loop)与催化结构域II相连,主要参与蛋白酶的二聚[19,21,24,25].

3CL蛋白酶在溶液中存在单体-二聚体的平衡,使用凝胶过滤、分析型超速离心、等温滴定量热、酶动力学等方法测出的解离常数有较大差别,范围从纳摩尔到微摩尔不等.其中Wei等[26]、Zhang等[22]和Tomar等[21]使用了相同的测量方法和拟合算法(超速分析离心方法和全局拟合算法),分别测得SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV3CL蛋白酶二聚体的解离常数为14、2.5和52μM.Zhang等也同时测得SARS-CoV3CL蛋白酶的解离常数,与他们报道的SARS-CoV-23CL蛋白酶解离常数相同,均为2.5μM.这与Wei等测得的14μM略有不同,这可能与不同实验室表达的SARS-CoV3CL蛋白酶N端不完全一致有关.3CL蛋白酶的活性形式已被证实为二聚体,且同一时刻二聚体中只有一个单体有活性[27,28].

图1SARS-CoV3CL蛋白酶晶体结构(PDBCode:1UK2)(网络版彩图)

Jin等[23]将已解出的12个不同冠状病毒的3CL蛋白酶晶体结构进行叠合分析,发现催化结构域I和II以及位于I和II之间的底物结合口袋在所有3CL蛋白酶中高度保守,这为靶向该蛋白酶活性口袋的广谱药物设计提供了结构基础.

二聚体结构中的两个亚基在空间取向上几乎互相垂直,其中一个亚基的N端片段(N-finger)与另一个亚基结构域II/III间的相互作用稳定了二聚体结构[16,17,18,19,20,21,22,23].N-finger插入到另一亚基结构域II和III之间,构成二聚体界面的重要部分.N-finger的缺失或突变会使蛋白酶解聚为单体,蛋白酶完全或基本失活[26].除形成单体外,N-finger缺失的蛋白酶也可以通过C螺旋结构域的交换形成无活性的异常二聚体.本课题组Wei等[26]研究发现SARS-CoV3CL蛋白酶的N端8肽可作为该酶的二聚界面竞争抑制剂.结构域III被认为是蛋白酶二聚体调控区,分析已解出的3CL蛋白酶结构表明结构域III本身以及与结构域II连接的柔性区构象变化很大[23].结构域III的缺失或突变同样会使蛋白酶解聚为单体[29,30,31,32].Rut等[33]认为,SARS-CoV和SARS-CoV-23CL蛋白酶的284～286位残基可能是二聚界面突变热点.SARS-CoV3CL蛋白酶的Thr285在SARS-CoV-23CL蛋白酶中被Ala取代,相邻的Ile286被Leu取代.SARS-CoV3CL蛋白酶晶体结构中一个亚基中的Thr285与另一亚基形成氢键,而在SARS-CoV-2中,这种氢键的损失使得两个亚基距离更近.有趣的是,在SARS-CoV-23CL蛋白酶结构中,因Ala285和Leu286的取代,两个亚基之间的空间被溶液中的氯离子所填充,这种构象并非蛋白酶的最佳折叠模式,由此可见284～286的柔性很大,可能是界面突变热点.有研究表明,SARS-CoV蛋白酶Ser284、Thr285和Ile286突变为Ala后使得酶活性最大可提升3.7倍[30].因此,N-finger和螺旋结构域III对于蛋白酶二聚不可或缺.二聚界面的破坏将造成蛋白酶构象和活性的变化,这为靶向3CL蛋白酶二聚界面的药物设计提供了结构线索.

在SARS-CoV3CL蛋白酶中,突变体G11A、S139A和R298A破坏了二聚界面,造成活性口袋氧负离子环等结构的破坏,形成稳定的单体结构.Gly11位于连接N-finger和结构域I的螺旋HelixA’上,其突变导致螺旋变短,使N-finger不能插到结构域II和III之间的界面中;R298A破坏了与N-finger的相互作用,使得结构域III不能精确定位,从而触发蛋白酶从二聚体向单体的转换;S139A使得催化中心的氧阴离子孔坍塌,通过长程作用影响了蛋白酶二聚.除S139A外,G11A和R298A几乎没有活性(<1%),而S139A的残留活性是因为溶液存在少部分二聚体.叠合G11A、S139A和R298A的晶体结构发现,结构域III比野生型偏离约40°[29,34,35].这种偏离在其他冠状病毒如传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus,IBV)[19]和MERS-CoV3CL蛋白酶的单体结构中也有报道[25].蛋白酶中连接结构域II和III结构域的柔性区介导了结构域III的定位,这表明3CL蛋白酶可能具有很大的结构可塑性,使得蛋白酶在二聚体和单体形式之间转换.

另外,对比SARS-CoVR298A与野生型蛋白酶的活性构象发现,Ser139-Phe140-Leu141肽段的结构明显不同.Ser139-Phe140-Leu141是氧阴离子孔的一部分,参与维持活性酶中S1底物结合口袋的正确构象.在活性构象中此三肽采取无规结构;而在无活性的构象中此三肽形成了短310螺旋结构,扭曲了氧阴离子孔[29].这种310螺旋结构在IBV3CL蛋白酶单体中也存在[19].本课题组Li等[36]将Leu141突变为Thr141,破坏了单体中的310螺旋结构,部分改善了底物结合口袋构象,最终获得了一个具有一定酶活性的单体突变体G11A/L141T/R298A/R299A,证实了该3肽的结构对于酶活性的关键调控作用.

2.23CL蛋白酶催化反应机理

胰凝乳蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,酶催化活性中心由丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸三联体构成.3CL蛋白酶具有类胰凝乳蛋白酶结构,其活性中心由半胱氨酸和组氨酸构成.本课题组Huang等[37,38]的研究表明,SARS-CoV3CL蛋白酶虽然活性部位的关键残基之一为半胱氨酸,但其底物水解过程遵循丝氨酸蛋白酶催化机理.蛋白酶活性中心Cys145突变为Ala145后完全失活,突变为Ser145后仍有水解活性.使用底物显色法测得野生型蛋白酶和突变体C145S最佳酶促反应pH分别为7.38和7.60(图2).野生型3CL蛋白酶His41和Cys145的pKa分别为6.38±0.02、8.34±0.02;突变体C145S的His41和Ser145的pKa分别为6.15±0.05和9.09±0.04.这表明Cys145在酶促反应中(pH7.4)以巯基SH形式存在,起广义酸的作用传递质子,而不是形成巯基-咪唑离子对参与催化反应[12],这意味着蛋白酶采取丝氨酸蛋白酶反应机理而非半胱氨酸酶机理.当pH高于8.6时硫醇基团的解离使得野生型酶活性急剧下降,而丝氨酸中羟基的pKa较高,C145S突变体在高pH时活性下降缓慢.有研究表明催化机理依赖于反应条件、底物类型等,如酰胺底物和酯底物的反应机理可能不同[39];Paasche等[40]通过模拟显示,底物可以诱导蛋白酶形成离子对进而增强底物特异性,抑制剂则不能,3CL蛋白酶反应机理需根据具体情况分析.

图2野生型SARS-CoV3CL蛋白酶和C145S突变体的催化反应活性随pH值变化图(网络版彩图)

3CL蛋白酶的催化中心保守性强,均由Cys和His组成,是否像其他丝氨酸蛋白酶一样存在第三个活性中心残基尚无定论.近日,Kneller等[41]报道了在室温下解析的SARS-CoV-23CL蛋白酶的晶体结构,发现水分子(H2Ocat)可能扮演了第三个催化残基的角色.在低温条件下(100K)解出的晶体结构中并未发现H2Ocat,因此他们认为,使用接近生理温度解析的晶体结构可以为分子对接和药物发现研究提供更多有用的信息.

2.3底物选择性

冠状病毒3CL蛋白酶的天然底物是病毒的多聚蛋白ppla和pplab.依照国际命名规则[42],底物序列中,酶切位点N端的残基按照距切点的距离依次为P1、P2、P3······,C端的残基依次称为P1′、P2′、P3′······.在酶中相应的结合口袋分别称为S1、S2、S3······和S1′、S2′、S3′······.3CL蛋白酶对底物序列识别专一性非常保守,底物特异性主要由P1、P2和P1′决定.在SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的3CL蛋白酶的底物序列中,P1位点的Gln完全保守(图3),Gln的突变造成底物不能被水解[43,44].P2位点为疏水氨基酸,主要为亮氨酸;P1′位点为小的脂肪族氨基酸,主要为丝氨酸和丙氨酸.在人类的蛋白中尚未发现具有相似底物特异性的蛋白酶,因此针对3CL蛋白酶的药物设计造成脱靶的可能性较小,P1位点Gln的保守性为靶向3CL蛋白酶的药物设计提供了关键信息[33].

虽然冠状病毒3CL蛋白酶底物识别序列高度保守,但不同病毒来源的蛋白酶底物也存在细微差别.研究发现,MERS-CoV3CL蛋白酶的S2口袋比SARS-CoV和SARS-CoV-23CL蛋白酶小,只能容纳偏小的疏水氨基酸,主要为亮氨酸,甲硫氨酸次之,未发现苯丙氨酸,这也是目前已知的2c组冠状病毒3CL蛋白酶的共性.而在SARS-CoV和SARS-CoV-23CL蛋白酶底物P2位置除Leu外,苯丙氨酸的比例有所提升[21].

本课题组Fan等[27]发现,SARS-CoV3CL蛋白酶的11个天然底物酶切位点中,源自蛋白酶N端的自我切割点效率最高,C端次之,这意味着在多聚蛋白中SARS-CoV3CL蛋白酶首先完成自我成熟.圆二色谱研究结果表明,多肽底物形成类似β折叠的伸展构象利于酶水解反应.为了进一步详细研究底物特异性并为抑制剂设计提供更多信息.Fan等[44]合成了34个截短和突变的底物肽,发现P1位点N端的残基对反应活性的影响比C端显著,P4、P3和P3′位置的残基对于底物识别和结合至关重要,提高P4和P3位置的β折叠构象倾向有助于酶与底物的结合和水解.此外,P3位点的正电荷(可能在酶的P3位和Glu-166之间形成盐桥)会增加酶的反应活性.因此抑制剂设计中需充分考虑分子刚性、对S3和S4口袋结合的专一性,来提高抑制剂的选择性和活性.他们根据底物选择性特征设计了一个8肽底物,此底物被水解的效率比N端自切序列提高了4.3倍.Chuck等[45]分析了冠状病毒1、2a、2b和3家族3CL蛋白酶的底物特异性得出与本课题组上述研究相似的结论,他们也根据有利于底物水解的特征组合设计并得到了两个水解活性高于天然底物1.7～4.3倍的8肽底物.

图3SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-23CL蛋白酶多聚蛋白酶中的天然底物识别序列(网络版彩图)

2.43CL蛋白酶成熟机理研究进展

3CL蛋白酶在未成熟之前作为ppla和pplab中的内源结构域存在,水解多聚蛋白前要完成自成熟[46].早期有报道认为,冠状病毒的3CL蛋白酶的自切过程需要膜的参与[47,48,49].Shan等[50]在SARS-CoV3CL蛋白酶的N端引入了31个氨基酸残基,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测不同反应时间底物和产物浓度的变化来研究3CL蛋白酶及其突变体的自切活性.他们发现,N端连了31肽的突变体C145S在体外可以发生缓慢自切,而以C145S突变体作为酶以多肽作为底物的反式酶切却不能发生,这说明多聚蛋白自切反应要比反式更敏感,更易进行.Lin等[51]建立了以融合蛋白为底物的体外反式酶活体系(transcleavage)和胞内多聚融合蛋白表达并自切的顺式(ciscleavage)酶活体系,用酶联免疫吸附(ELISA)方法和化学发光方法分别对两种体系的3CL蛋白酶活性进行定量,他们认为这种方法为高通量筛选奠定了基础.

3CL蛋白酶成熟机制一直存在争议.Hsu等[52]解析了SARS-CoV3CL蛋白酶突变体C145A的二聚体晶体结构,二聚体中一个亚基活性口袋结合了另一个不对称单元中单体C末端的6个氨基酸,他们认为这种结合方式模拟了酶与产物结合,提示了可能的成熟机制.他们将野生型SARS-CoV3CL蛋白酶两端分别连接10个氨基酸,模拟多聚蛋白的自我成熟并提出可能的机制,认为N端自切在多聚蛋白的单体间完成,N端切除后蛋白酶形成不成熟的二聚体,通过分子间作用切去其他分子的C端,N和C端自由的蛋白酶形成成熟二聚体.Chen等[53]通过研究与蛋白酶二聚有关的界面氨基酸Arg4、Glu290和Arg298的突变体的自切活性提出成熟机制,他们认为多聚蛋白首先形成瞬时二聚体,在二聚体内部完成N端自切,然后形成不成熟二聚体,通过分子间作用切去C端.Muramatsu等[54]测定了成熟蛋白酶、N端或C端和N/C两端连接自切序列的蛋白酶的水解活性,根据N端和C端自切效率提出了成熟路径的数值模型.他们认为,多聚蛋白自切第一步在N端和C端都有可能发生,只是发生在N端自切的概率更大.

本课题组Wei等[55]发现,底物有增强蛋白酶二聚的作用.SARS-CoV3CL蛋白酶的二聚体结合能力比较弱[28],超速分析型离心方法[26]得出纯蛋白酶的二聚解离常数为14.0μM,在发生酶催化反应时二聚推测的解离常数为1μM,表明底物可以诱导蛋白酶二聚.选用底物类似物N-萘甲基靛红-5-甲酰胺(5f)[56]测定1μMSARS-CoV3CL蛋白酶在不同浓度5f下二聚体含量,发现5f同样可以诱导蛋白酶二聚.研究结果表明,随着底物浓度的升高,SARS-CoV3CL蛋白酶会形成更多的二聚体,而二聚体含量的提高又反过来提高酶的活性,这种双向别构调控机制有可能是病毒用来调控多聚蛋白水解速率和组装时机的一种方法.

Cheng等[57]随后也报道了底物可以增强SARS-CoV3CL蛋白酶突变体R298A/L二聚的现象.底物诱导蛋白酶二聚的调控方式在MERS-CoV3CL蛋白酶中也被报道[21].MERS-CoV3CL蛋白酶二聚能力较SARS-CoV3CL蛋白酶更弱,超速分析型离心法测得蛋白酶解离常数为52μM,且亚基之间的交换速率很慢为10-4s-1.酶反应二级速率常数为同家族HKU5-CoV和HKU4-CoV3CL蛋白酶的1/3～1/4,为2b家族SARS-CoV3CL蛋白酶的1/5.Tomar等认为,MERS-CoV3CL蛋白酶二聚体的形成是通过非保守氨基酸的长程作用调控的.MERS-CoV3CL蛋白酶在酶促反应中解离常数为7.8±1.3μM,二聚能力约为纯3CL蛋白酶的7倍,这表明酶促反应中底物诱导了蛋白酶形成二聚体.超速分析型离心结果表明,MERS-CoV3CL蛋白酶与两个肽类抑制剂6号化合物和10号化合物分别混合后,沉降系数由从单聚体向二聚体移动,并且10号化合物在低浓度时(<0.5μM)可激活蛋白酶活性.基于上述结果,他们提出了MERS-CoV3CL蛋白酶的成熟机制,比Chen等[53]的更加具体化.多聚蛋白N端的切割需要形成瞬时二聚体并且在二聚体分子内完成,C端的切割在二聚体分子间完成,成熟的MERS-CoV3CL蛋白酶聚集状态依赖于底物或配体的浓度.

Louis等[58]研究了HIV蛋白酶成熟过程中的酶动力学,提出其成熟机制.HIV蛋白酶N端的水解发生在多聚蛋白分子形成的二聚体内部,即分子内反应.这是因为N端自切过程中酶催化速率的增长与蛋白酶浓度的增加呈线性关系,即该过程中遵循一级反应的模式,表观二级速率常数kcat/Km不发生变化.

本课题组Li等[43]构建了两个多聚荧光蛋白HisCFP-XX(Q/E)-3CLP-YFP和His-CFP-XX-C145A-YFP,用于模拟SARS-3CL蛋白酶的成熟过程,根据该过程中的酶动力学特征提出了成熟机制.荧光多聚蛋白从N端到C端依次是:青色荧光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)、3CL蛋白酶N端自切序列(SIT-SAVLQ↓SGF,XX)、3CL蛋白酶或突变体C145A和黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP).酶切位点P1的Gln突变为Glu和C145A的引入使两种多蛋白不能自我切割.凝胶色谱和分析型超速离心分析表明,荧光多聚蛋白以及N端消化产物3CLP-YFP-His在溶液中为单体,已报道的底物类似物5f能诱导其形成二聚体.His-CFP-XX(Q/E)-3CLP-YFP、3CLP-YFP-His和野生型蛋白酶在酶促反应中表现相同,反应初始速率与酶浓度增加呈非线性关系,随着酶浓度的增加,表观二级速率常数kcat/Km不断增加,意味着蛋白酶切自身N端和C端的反应发生在分子间.这与Hsu等[52]在晶体结构中观察到C145A二聚体中一个单体活性口袋结合另一个不对称单位中蛋白C端的6个氨基酸的结果一致.比较二聚能力和酶活性发现,多聚蛋白His-CFP-XX(Q/E)-3CLP-YFP最低,3CLP-YFP-His次之,野生型蛋白酶最强.根据该研究结果,我们提出了SARS-CoV3CL蛋白酶成熟机制的新版本.多聚蛋白初始表达时,自身作为底物诱导形成极少量的活性瞬时二聚体酶,水解其他分子的N端位点,释放出自由的N端;N端自由但C端未被水解的蛋白酶活性和二聚能力较其母体有了很大的提高,将通过分子间作用进一步水解C端自切位点.最后,随着具有自由的N端和C端的野生型蛋白酶单体浓度的升高,单体组装成活性形式的二聚体.

SARS-CoV3CL蛋白酶成熟过程中的底物诱导机制提供了一种酶活性调控和病毒组装的可能方式.在病毒复制初期,只有微量的酶或底物,底物的诱导使酶活化;随着酶催化反应的进行,底物浓度不断减少,成熟蛋白酶不断增加,促使更多的活性二聚体产生以及底物的进一步消耗至殆尽.病毒这种调控方式在酶活控制和底物的利用方面非常高效经济.除了3CL蛋白酶外,可能还有更多的多结构域蛋白酶采用这种调控方式[43](图4).

3、3CL蛋白酶抑制剂研究

3CL蛋白酶的结构与功能研究为靶向药物设计奠定了基础.随着计算机模拟技术和化合物筛选技术的飞速发展,目前已有大量具有SARS-CoV3CL蛋白酶和MERS-CoV3CL蛋白酶抑制活性的合成化合物和天然产物报道,但遗憾的是尚没有进入临床阶段的化合物.亟需在这些工作的基础上寻找更有效的新冠治疗药物.在3.1小节中,我们对目前已报道的SARS-CoV3CL蛋白酶和MERS-CoV3CL蛋白酶抑制剂进行梳理,总结分析其结构与活性关系及可能的作用机制;在3.2小节中介绍SARS-CoV-23CL蛋白酶抑制剂的最新发现.希望能够为COVID-19的治疗药物研发提供参考.

图43CL蛋白酶活性调控机制(网络版彩图)

3.1SARS-CoV3CL蛋白酶和MERS-CoV3CL蛋白酶抑制剂的研究进展

根据其结构和来源,抑制剂可以分为短肽类抑制剂、有机小分子抑制剂、天然产物抑制剂和金属配合物等.根据化合物与3CL蛋白酶催化活性位点的作用模式,又可分为共价结合型或非共价结合型.共价结合型抑制剂主要与3CL蛋白酶活性部位Cys145的巯基形成共价键使其失活,这类抑制剂分子中通常含有一个亲电中心,能够接受S原子的亲核进攻;而非共价结合抑制剂大多为底物竞争型抑制剂,也有少数分子结合在3CL蛋白酶的二聚界面上.

3.1.1短肽类抑制剂

短肽类抑制剂主要为二至四肽,按其不同的末端反应头或是骨架结构又可以分为10类,分别为:肽乙烯基酯(砜)类抑制剂、肽醛类抑制剂、肽磺酸钠类抑制剂、肽α-酮酰胺类抑制剂、肽(氮杂)环氧化物类抑制剂、肽卤甲基酮类抑制剂、肽杂环酮类抑制剂、肽硝基苯胺类抑制剂、对称肽类抑制剂和丝氨酸骨架拟肽类抑制剂.

(1)肽乙烯基酯(砜)类抑制剂

AG7088(化合物1)是最早发现的鼻病毒3C蛋白酶的肽类抑制剂[59],其中α,β-不饱和酯可以作为Michael加成的受体,与蛋白酶的半胱氨酸发生共价反应,不可逆地抑制蛋白酶活性(图5(a)).研究表明,AG7088对SARS-CoV3CL蛋白酶没有明显的抑制作用[60],计算分析表明AG7088的P2位对氟苯甲基的体积稍大,虽然可以伸入蛋白S2口袋,但构象的偏转使得内酰胺部分无法占据S1口袋,进而导致α,β-不饱和酯药效团偏离活性残基Cys145,无法共价抑制蛋白酶活性.根据计算模拟结果,进行结构优化得到活性化合物2和类C2对称的化合物3(图6).Yang等[61]针对冠状病毒3CL蛋白酶保守的S1、S2和S4底物识别关键口袋,设计了一系列以α,β-不饱和酯为药效团的广谱抑制剂,其中N3(化合物4)对SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性最佳.2016年,Yang等[62]也以化合物1为先导分子,进行构效关系研究,发现五元内酰胺环适宜作为P1位取代基,而P2位选择亮氨酸侧链活性更优.相较于苯丙氨酸(化合物5)和对氟苯丙氨酸,亮氨酸取代(化合物6)活性提高约4倍,表明刚性的、平面的苯环结构并不是S2疏水口袋的最优选择.P3位引入亲脂的叔丁基会提高10倍活性(比较化合物6和7),P4位则是苄氧基取代活性优于甲基异唑取代.

(2)肽醛类抑制剂

Yang等[62]在前文介绍的化合物7的基础上,为了提高化合物的细胞活性,将P2位更换为环己基丙氨酸,同时为了避免C端反应基团被酯酶水解,将共价反应头由不饱和酯换为醛类(反应机理见图5(b)),得到化合物8(图7).化合物8的抑制常数Ki值为53nM,抗SARS病毒的半数有效浓度(EC50)值为0.6μM.Akaji等[63]发现,成熟的SARS-CoV3CL蛋白酶在Arg188/Gln189处易被降解,而将188位的Arg突变成Ile后蛋白稳定性增强,并且催化活性提高了接近10[6]倍.随后,该团队试图采用R188I突变蛋白去发现活性更强的抑制剂.根据天然底物的序列,设计并合成了C-末端为醛类的五肽抑制剂(化合物9),其抑制SARS-CoV3CL蛋白酶R188I的半数抑制浓度(IC50)值为37μM.采用与化合物9相同的氨基酸序列,将C端更换为不可逆的Michael受体,得到化合物10,以及类似物11和12,从表1可以看出,醛类抑制剂比不饱和酯类抑制剂对R188I突变蛋白具有更强的抑制活性[64].以8为先导化合物,首先考察不同类型的P1取代基对活性的贡献,得到化合物13,IC50为5.7μM.根据SARS-CoV3CL蛋白酶R188I蛋白与化合物8的共晶结构,对P2位进行结构优化,发现P2位为环己基时活性最佳,IC50为65nM(化合物14).为了解决肽链易被酶解以及共价结合的毒性问题,该团队在前期研究的醛类抑制剂基础上,引入新型骨架来代替肽键和采用更安全的反应头基团替换醛基.先后设计了氢化异喹啉骨架(化合物15)[65]和八氢异色烯骨架(化合物16)拟肽抑制剂,对化合物15进一步改造得到了亲水性增加的化合物17和硫缩醛反应头衍生物18,遗憾的是,这些化合物的酶活抑制能力一般,有待进一步优化.2017年,Kumar等[66]通过化学改造得到了一系列可以同时抑制SARS-CoV3CL蛋白酶和MERS-CoV3CL蛋白酶的醛类抑制剂,其中有3个类似物(化合物19、20和21)抗MERS-CoV的活性在微摩尔浓度.

(3)肽磺酸钠类抑制剂

用于猫的冠状病毒感染治疗药物GC376(化合物22,图8)[67]是一种广谱的病毒蛋白酶抑制剂,分子结构中的磺酸盐易离去,生成醛类的活性中间体(GC373),进而抑制蛋白酶的活性.Kim等[68]考察了GC376和GC373对SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制活性,IC50分别为4.35和3.48μM.2018年,Chang课题组[69]为了获得高活性的抗MERS-CoV药物,解析了GC376与MERS-CoV3CL蛋白酶的复合物晶体结构.在此基础上,该团队在P4位引入了取代的哌啶基团,一方面可以增强化合物与S3口袋的结合,另一方面还可以改善化合物的溶解性.其中,化合物23和24表现出了最强的抗病毒能力,对MERS-CoV的EC50分别为0.5和0.8μM.

图5短肽类化合物抑制3CL蛋白酶的可能机理:(a)肽乙烯基酯类;(b)肽醛类;(c)肽磺酸盐类;(d)肽α-酮酰胺类;(e)肽环氧化物类;(f)肽卤甲基酮类;(g)邻苯二甲酰肼类拟肽(网络版彩图)

图6肽乙烯基酯类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(4)肽α-酮酰胺类抑制剂

α-酮酰胺末端可以与半胱氨酸发生如图5(d)所示的共价结合,同时具有多个氢键供体和受体,相较肽醛类抑制剂具有更强的稳定性,是常用的病毒蛋白酶抑制剂反应头.近期,Zhang等[70]研发了一类新型的拟肽类广谱抗病毒分子,并且通过共结晶技术证实了该类化合物的共价作用机制.他们主要针对P2位取代基进行结构优化,发现了多个具有微摩尔级别广谱抗病毒活性分子,其中化合物25(图9)的抑制SARS-CoV3CL蛋白酶活性最佳,IC50为0.24μM.值得一提的是,多个化合物在MERS病毒感染的Huh7细胞模型中,抗病毒活性达到了纳摩尔级别,其中活性最佳的是化合物26,EC50为0.4nM.

(5)肽(氮杂)环氧化物类抑制剂

氮杂肽环氧化物(aza-peptideepoxides,APEs)在早期用作CD半胱氨酸蛋白酶家族抑制剂[71],Lee等[72,73]通过化合物库筛选发现,APE类化合物可以不可逆抑制SARS-CoV3CL蛋白酶(化合物27,图10).复合物晶体结构表明,3CL蛋白酶的C145-SH和APE环氧环的3-位碳原子之间形成共价键(图5(e)).通过酶动力学分析和晶体解析发现,只有环氧环的C3为S构象才能与蛋白酶作用.Martina等[74]对含有亲电基团的化合物进行筛选,发现含有氮杂环丙烷结构的化合物28对SARS-CoV3CL蛋白酶具有一定的抑制活性.

图7肽醛类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

表1含不同类别Michael受体化合物对SARS-CoV3CLR188I蛋白酶抑制活性的比较

图8肽磺酸盐类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图9肽α-酮酰胺类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(6)肽卤甲基酮类抑制剂

以半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)抑制剂为先导分子[75,76],进行结构优化,发现这类含有卤甲基酮的化合物可以有效抑制SARS-CoV的复制[77].其中化合物29(图11)活性最佳,EC50为2.5μM,安全指数(selectivityindex,SI)>40,并且在小鼠模型中评估安全性良好.

Sydnes等[78]发现,末端为三氟甲基酮的拟肽化合物(30)也可以抑制SARS-CoV3CL蛋白酶活性,但由于化合物自身可以发生环化反应,生成的环状末端不易进入蛋白的活性中心,故而活性一般.为了避免环化现象,该团队在P1位取代基进行优化,得到了活性提高的化合物31[79].另一团队通过构效关系分析发现,采用与底物相同氨基酸序列的化合物32活性最佳,对蛋白的抑制活性呈现时间依赖现象,证实了三氟甲基酮类拟肽也可以与半胱氨酸发生共价结合[80].

图10肽(氮杂)环氧化物类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图11肽卤甲基酮类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(7)肽杂环酮类抑制剂

为了避免化合物30的自身环化现象,该团队还考察了将三氟甲基酮反应头更换为噻唑酮和苯并噻唑酮化合物的抑制效果[79].其中,噻唑酮类化合物抑制剂活性最佳的是化合物33(图12),Ki为2.20μM.苯并噻唑酮化合物经过几轮结构优化,得到了活性较好的三肽抑制剂(34)[81]和分子量更低的二肽抑制剂(35)[82],Ki分别为3.1和6.0nM.

Jain等[83]在前期的工作中发现了一类新型的α-位为邻苯二甲酰肼的谷氨酰胺-酮类似物对人鼻病毒(HRV-14)和甲肝病毒(HAV)的3C蛋白酶具有较强的抑制活性,通过实验筛选发现,这类化合物可逆地抑制SARS-CoV3CL蛋白酶,其中化合物36活性最佳,IC50为0.6μM[84].邻苯二甲酰肼中β-和β′-位的连续氨基可以形成分子内氢键,加强了羰基的亲电能力,使得化合物倾向于与Cys145的巯基形成四面体过渡态.随后,这类抑制剂与SARS-CoV3CL蛋白酶的共晶结构被解析,他们发现这类抑制剂可以与Cys145形成一种不常见的硫杂环丙正离子中间体,再通过介导一分子的水形成半硫缩醛结构,如图5(g)所示[85].

(8)肽硝基苯胺类抑制剂

Shie等[86]筛选了含有多种苯胺的肽类化合物对于SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制活性,发现由邻氯对硝基苯胺、L-苯丙氨酸和4-二甲基氨基苯甲酸组成的化合物37(图13)的活性最佳,是一种竞争性的非共价抑制剂.同时,化合物37具有很好的选择性,对胰蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶的抑制IC50分别为110、200和220μM,而对SARS-CoV3CL蛋白酶的IC50为0.06μM.

图12肽杂环酮类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(9)对称型肽类抑制剂

Wu等[87]采用SARS病毒感染的VeroE6细胞模型对含有上市药物、天然产物和合成化合物的10000个分子的库进行抗病毒筛选,发现了几个可以抗SARS病毒的化合物.其中有两个化合物为抗HIV病毒的分子,一个在病毒入侵过程中发挥作用,另一个则是HIV蛋白酶抑制剂(化合物38,图14),该化合物可以有效抑制SARS-CoV3CL蛋白酶的活性.进一步结构优化得到活性提高的化合物39和40,Ki分别为0.34和0.073μM.化合物40的选择性也有明显的增强,在100μM高浓度下对HIV蛋白酶没有明显抑制作用[88].

(10)丝氨酸骨架拟肽类抑制剂

为了解决肽键易水解的问题,Akaji团队也尝试了在肽醛类化合物基础上,通过骨架跃迁设计得到基于丝氨酸骨架的新型拟肽化合物41[89]和异丝氨酸化合物42[90](图15),但对酶的抑制能力还有待提高.

图13肽硝基苯胺类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

3.1.2有机小分子抑制剂

(1)吡啶和苯并三唑类抑制剂

Jacobs等[91]通过对NIH分子库进行高通量筛选发现类二肽化合物SID49730186(化合物43,图16)对SARS-CoV3CL蛋白酶具有较好的抑制活性(对SARS-CoV3CL蛋白酶的IC50为2.2μM,同时对SARS-CoVPL蛋白酶的IC50为34μM).以其为先导分子,利用Ugi多组分点击反应快速地获得了一系列衍生物,得到了选择性提高的化合物44.对44进行手性拆分,发现R型异构体(ML188,化合物45)为活性构象,对SARS-CoV3CL蛋白酶的IC50为1.5μM,对SARS-CoVPL蛋白酶无效,而其对应的S型异构体则没有抑制活性.

为了寻找更有效的非共价抑制剂,该团队随后对MLPCN库进行筛选,获得苗头分子46.为了降低化合物的分子量,研究者将P3取代基截断得到化合物47,进一步结构优化得到第一个亚微摩尔抑制活性的化合物48[92].

图14对称型肽类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图15丝氨酸骨架拟肽类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(2)靛红类抑制剂

基于人鼻病毒3C蛋白酶与SARS-CoV3CL蛋白酶活性位点的相似性,研究了人鼻病毒3C蛋白酶靛红类抑制剂[93]对于SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制活性.2005年,Chen等[94]报道了靛红化合物对SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制活性在微摩尔级别,其中代表化合物为49和50(图17).2006年,本课题组[56]通过计算机模拟得到靛红衍生物与SARS-CoV3CL蛋白酶的结合模式,在靛红母核的C-5位引入甲酰胺模拟天然底物中的Gln侧链,得到了活性更优的化合物51.质谱研究表明,不同于与鼻病毒3C蛋白酶的共价结合方式,化合物51以非共价作用抑制SARS-CoV3CL蛋白酶的活性.此外,本课题组[95]在前期发现的靛红分子基础上,连接了作用于蛋白酶二聚界面的8肽得到了双功能抑制剂,其中化合物52活性最高,IC50为3.8μM.通过超速离心沉降速率方法研究发现双功能化合物在不同浓度下表现出诱导或者是抑制二聚的双重能力,为以小分子为工具研究3CL蛋白酶活性调节机制提供了一个示例.

(3)吡唑啉酮和嘧啶类抑制剂

Ramajayam等[96]在高通量筛选得到的SARS-CoV3CL蛋白酶抑制剂53[97]和54[98](图18)的基础上,设计并合成了一系列吡唑啉酮化合物,有几个化合物表现出了较好的抑制活性,其中化合物55的IC50为5.5μM.同时该课题组[99]发现,嘧啶衍生物也具备相当的活性,代表化合物56的IC50为6.1μM.

图16吡啶和苯并三唑类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图17靛红类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图18吡唑啉酮和嘧啶类的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(4)芳香硼酸类抑制剂

Bacha等[100]针对冠状病毒蛋白酶活性位点附近的丝氨酸残基结合簇(Ser139、Ser144和Ser147),设计了一类双活性芳香硼酸抑制剂,活性最佳的化合物57(图19)的Ki值低至40nM.等温滴定微量热法测试发现,化合物与蛋白以焓驱动的可逆方式结合,表明化合物具有很强的结合能力,可以在该骨架分子基础上开展更多的研究.

(5)依他尼酸类抑制剂

2005年,Kaeppler等采用高效液相色谱法(HPLC)技术对含有亲电基团的化合物库进行筛选,得到了依他尼酸的叔丁酰胺化合物58(图20),其Ki为45.8μM.分子对接表明,化合物58横跨活性口袋,叔丁基伸向疏水的S4口袋,二氯苯基占据S3附近区域.研究人员对伸向S4口袋的叔丁酰胺基团进行构效研究得到活性略有提高的化合物59,由于化合物尚未占据活性位点的S1′、S1和S2口袋,结构上还有较大的优化空间.

(6)杂环酯类抑制剂

Wu及其同事[101]发现了一系列苯并三唑酯类化合物(60～63,图21),对SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制活性在纳摩尔水平,但并没有表现出明显的抗病毒效果.进一步的质谱测试表明化合物对蛋白C145进行了不可逆的酰化修饰.Blanchard等[102]通过高通量筛选发现,吡啶基酯(化合物64)可以有效地抑制SARS-CoV3CL蛋白酶,将结构当中的噻吩环更换为2-呋喃基(65和66)或2-吲哚基(67)取代后[103,104],活性提高了约10倍.

图19芳香硼酸类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图20依他尼酸类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图21杂环酯类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

(7)芳香亚甲基酮和氟亚甲基酮类抑制剂

活性杂环酯类化合物具有易被水解以及特异性差、毒性强的缺点,为了得到稳定的且非共价的抑制剂,Zhang等[105]在前期发现的吡啶基活性酯类基础上,设计了一种芳香亚甲基酮类分子,活性最佳的为化合物68,IC50为13μM.出乎该团队预期的是,在亚甲基上引入氟后活性下降(69,图22),且氟取代越多活性越差.酶动力学和电喷雾质谱法(ESI-MS)实验表明,此类化合物是采用非共价、可逆的机制发挥作用.

(8)不对称的芳香二硫化物类抑制剂

在动态组合化学中,不对称的二硫化物是常用的研究工具,该类化合物被报道具有多种生物功能.Wang等[106]合成了40个不对称的芳香二硫化物(图23),对SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制IC50为0.516～5.954μM,酶动力学研究表明化合物是以可逆的非竞争方式与蛋白结合.

(9)基于筛选手段获得的抑制剂

2005年,Chen等[107]通过分子对接从含有8000余种化合物的MDL-CMC化合物库中发现5-羟色胺受体拮抗剂肉桂硫胺(72,图24)对SARS-CoV3CL蛋白酶和HCoV-229E3CL蛋白酶有抑制作用,IC50分别为4.92和4.68μM.

2005年,本课题组[108]结合分子对接、药效团模型和类药性分析等方法对多个数据库进行虚拟筛选,并选择其中40个化合物进行实验测试,发现3个活性分子,其中钙调蛋白拮抗剂卡米达佐(化合物73)的Ki值为61μM.

图22芳香亚甲基酮和氟亚甲基酮类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

图23不对称的芳香二硫化物类抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

2006年,Tsai等[109]在Maybridge数据库中筛选出21个化合物的IC50≤30μM,其中3个化合物具有相似的结构.以这3个化合物为先导,进行相似性筛选,得到了另外25个分子,其中化合物74的活性最佳,并对这28个化合物进行3D-定量结构-活性关系(QSAR)研究得到了SARS-CoV3CL蛋白酶抑制剂的药效团模型.该团队[110]同时对另外两种骨架化合物也进行了类似物筛选,分别得到了活性提高的化合物75和76,IC50分别为0.3和3μM.通过结构解析发现,化合物75与蛋白的结合模式不同于以往报道的任何抑制剂,75主要通过强氢键和疏水作用与蛋白S3～S5口袋结合,并且促进蛋白构象发生转变,使得活性部位的His41残基发生偏转,远离催化位点C145,导致蛋白失活.

图24其他抑制剂的结构与SARS-CoV3CL蛋白酶抑制活性

2008年,Mukherjee等[111]利用Gold对接软件对AsinexPlatinum化合物库进行虚拟筛选,发现化合物77和78对SARS-CoV3CL蛋白酶具有一定的抑制作用.

2011年,Kim等[112]利用Autodock对接软件对Chembridge化合物库进行虚拟筛选,得到7个活性化合物,IC50在38～101μM之间,其中化合物79和80(图24)为竞争性抑制剂,Ki值分别为9.11和9.93μM.

Kao等[113]基于化学遗传学方法,从含有50240个小分子的化合物库中筛选出104个化合物具有抗SARS-CoV活性,其中有2个化合物为SARS-CoV3CL蛋白酶抑制剂,化合物MP576(81)的IC50为2.5μM,抗病毒的EC50为7μM.

Blanchard等[102]通过一系列的虚拟筛选和实验筛选,从50000个化合物中挑选出5个活性分子(化合物82～86),其中83和84具有更好的选择性,对测试的其他4种蛋白酶(HAV3C蛋白酶、NS3蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶)没有效果.

Lee等[114]首先对含有621000个化合物的ZINC库进行虚拟筛选,再对获得的41000个化合物进行实验筛选,得到活性最佳的化合物为87,Ki值为11.1μM.

动态偶联筛选(dynamicligationscreening)是一种灵敏度高的检测蛋白与配体相互作用的手段,该方法的基本原理是在一个明确与靶蛋白结合的分子上连接可反应的基团(该分子称为探针),用于筛选与靶蛋白其他部位结合的片段,可以再以筛选得到的片段为探针,进一步筛选与靶蛋白余下位点结合的片段.基于该策略,Schmidt团队[115]以SARS-CoV3CL蛋白酶为靶标经过多轮的反复筛选,最终获得了Ki值为2.9μM的先导分子(88).

3.1.3来源于天然产物的抑制剂

天然产物来源丰富,其结构多样、作用机制新颖,是药物研发的重要来源.人类采用天然产物治疗相关疾病的历史可追溯到千年前,而近几十年来天然产物也被广泛用于抗病毒领域.2002年SARS暴发后许多来源于天然产物、结构新颖的SARS3CL蛋白酶抑制剂被陆续报道,为抗SARS病毒的药物开发提供了有潜力的先导化合物(表2).

Chen等[116]应用表面等离子共振(SPR)和荧光共振能量转移(FRET)技术,针对SARS-CoV3CL蛋白酶构建了抑制剂的高效筛选平台,在MDL-ACD化合物库中筛选到了天然产物五羟黄酮-3-β-半乳糖苷(89),其抑制IC50为42.8μM.该团队通过分子对接手段发现蛋白Gln189残基对89与酶的结合起关键作用,并采用点突变实验进行验证.相应的L-岩藻糖衍生物对SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制活性则提高了一倍,IC50为24.1μM.Jo等[117]也发现黄酮类植物成分草质素(90)、野漆树苷和大蓟苷可以抑制SARS-CoV3CL蛋白酶的活性.Ryu等[118]发现,来源于日本榧树的四种双黄酮类化合物可以抑制SARS-CoV3CL蛋白酶的酶活性,其中穗花杉双黄酮(91)活性最佳,是一类非竞争性抑制剂,IC50为8.3μM.同样源自日本榧树的二萜类化合物则抑制活性不佳,最好的化合物为弥罗松酚(92),IC50为49.6μM.从东北雷公藤中提取得到的三萜化合物具有更优的抑制活性,其中伊圭甾醇(93)的IC50为2.6μM[119].Wen等[120]通过细胞病变效应(cytopathogeniceffect,CPE)实验筛选了221个植物提取物抗SARS病毒的效果,其中桦木酸(94)和桧脂素(95)对SARS-CoV3CL蛋白酶的抑制IC50分别为10和25μM.Park等[121]考察了明日叶提取物对SARS蛋白酶的抑制情况,包含有9个烷基化查尔酮和4个香豆素类化合物,其中活性最佳的黄当归酚E(96)可以同时抑制SARS-CoV3CL蛋白酶和SARS-CoVPL蛋白酶活性,IC50分别为11.4和1.2μM.

3.1.4金属配合物

近十余年来陆续有报道,金属配合物,尤其是汞和锌的配合物对多种病毒蛋白酶,如NV-3CL蛋白酶[122]、HCVNS3蛋白酶[123]、SARS-CoV木瓜蛋白酶[124]以及SARS-CoV3CL蛋白酶有较强的抑制作用.对含有960个生物活性化合物的库进行筛选[125],发现含汞化合物,醋酸苯汞(97)、硫柳汞(98)和硝酸苯汞(99),可以竞争性地抑制SARS-CoV3CL蛋白酶活性(表3).此外,他们还发现锌配合物具有更强的抑制活性,其中吡啶硫酮锌(100)的Ki为0.17μM,优于锌离子本身的抑制活性(Ki为1.1μM).通过X晶体衍射技术观察到醋酸苯汞与SARS-CoV3CL蛋白的C44、M49和Y54残基形成平面结构,占据蛋白S3口袋,而锌配合物则与H41、C145催化残基共同形成四面体结构[126].虽然金属配合药物在抗肿瘤领域得到了广泛的应用,但作为病毒抑制剂的研究仍处于起步阶段,明确的作用机制和安全性问题仍需进一步探索.

表2源自天然产物的SARS-CoV3CL蛋白酶抑制剂与抑制活性

3.2SARS-CoV-23CL蛋白酶抑制剂的新发现

自SARS-CoV-2引起的疫情暴发以来,各国科学家们一直在致力于寻找有效的抗病毒药物.目前报道的针对SARS-CoV-23CL蛋白酶的抑制剂主要是在前期开发的3CL蛋白酶抑制剂基础上优化而来或是老药新用.

Dai等[127]在前期工作基础上,基于SARS-CoV-23CL蛋白酶的三维结构,设计并合成了两个肽醛类抑制剂11a(103)和11b(104).这两个化合物对SARS-CoV-23CL蛋白酶表现出强抑制活性,IC50分别为0.053和0.040μM,同时这两个化合物具备较好的抗病毒效果,EC50分别为0.53和0.72μM.复合物晶体结构表明,这两个化合物均作用于底物结合口袋,并且同上文所描述的醛类化合物的作用机制一致,化合物的醛基部分与催化位点的Cys145共价形成硫半缩醛结构.值得关注的是,这两个化合物除了具有较好的抗病毒活性外,还表现出良好的体内药代动力学性质和安全性,具有开发成抗SARS-CoV-2药物的潜力.

Zhang等在前期工作中已经发现了含α-酮酰胺的拟肽化合物对冠状病毒和肠病毒的3CL蛋白酶具有广谱的抑制作用.在前期开发的11r(化合物26)基础上,为了避免肽键被水解,以延长化合物在血浆中的半衰期,研究者将P3-P2间的酰胺键闭环在吡啶酮中,如图25所示.此外,为了增强化合物在血浆中的溶解度以及减少与血浆蛋白的结合,研究者将疏水性强的肉桂酰基换成了疏水性稍弱的叔丁氧酰基,得到化合物13a(105).通过实验测试发现,相较于11r,13a在血浆中的半衰期提高了约3倍,体外动力学血浆溶解度增强了约19倍,同时热力学溶解度也提高了约13倍,但是对SARS-CoV-23CL蛋白酶的抑制活性较11r也有所降低.通过解析SARS-CoV-23CL蛋白酶的晶体结构,发现其S2口袋能够适应较小的取代基团,因此研究人员为了提高化合物对SARS-CoV-23CL蛋白酶的抑制能力,放弃了更适于广谱活性的P2环己基部分,更换为较小体积的环丙基,得到活性提升的化合物13b(106).化合物13b具有一定的抗病毒活性,对SARS-CoV-2的EC50为4～5μM,若将13b末端的疏水叔丁氧酰基去掉,得到的化合物14b(107)则完全丧失细胞活性.研究发现,与13a相比,13b在血浆中的停留时间更长,清除速度更慢.此外还发现,13a和13b在组织分布中体现出肺部的倾向性,并且雾化给药后仍可在肺组织中达到较高浓度[22].

图25肽α-酮酰胺类SARS-CoV-23CL蛋白酶抑制剂的结构与抑制活性.其中抑制剂的结构优化片段用彩色的椭圆形或圆形标记(网络版彩图)

治疗猫冠状病毒的药物GC376(22)和GC373被证实对于SARS-CoV-23CL蛋白酶有较好的抑制效果,IC50分别为0.19和0.40μM,同时这两个化合物具备一定的抗SARS-CoV-2效果,EC50分别为0.92和1.50μM[128].

Ma等[129]测定了多种已知的蛋白酶抑制剂对于SARS-CoV-23CL蛋白酶的抑制活性,发现了4个可以抑制SARS-CoV-23CL蛋白酶及SARS-CoV-2病毒活性的化合物.其中,波普瑞韦(Boceprevir,108,图26)是美国食品和药物管理局(FDA)批准上市的抗丙型肝炎药物,其剂量和安全性已有大量数据可供参考,可以作为设计新冠临床试验的依据;该团队也发现了GC376(22)在SARS-CoV-2上的效果,此处不再赘述;另外,两个化合物是钙蛋白酶抑制剂II(109)和XII(110),目前还处于早期研发阶段,这两个分子可以同时抑制SARS-CoV-23CL蛋白酶和宿主的组织蛋白酶.前期研究表明,宿主的组织蛋白酶在SARS-CoV-2侵入细胞和释放RNA的过程中起到关键作用,故而可将这两个化合物作为先导分子,开发双功能的抗病毒药物.

Jin等[130]在第一时间成功解析了SARS-CoV-23CL蛋白酶的三维结构,并且应用多种药物开发策略进行SARS-CoV-23CL蛋白酶抑制剂的研究.该团队前期工作中发现的SARS-CoV3CL蛋白酶抑制剂N3(4)对SARS-CoV-23CL蛋白酶也有一定的抑制活性,共价反应的kobs/[I]为11300±880M-1s-1.他们同时对本地化合库进行虚拟筛选并对大约包含10000个临床药物、天然产物和活性成分化合物库进行高通量实验筛选,发现了数种有显著抑制活性的苗头分子.包括上市药物(双硫仑(disulfiram,111)和卡莫氟(carmofur,112))、临床或临床前研究化合物(依布硒(ebselen,113)、紫草素(shikonin,114)、tideglusib(115)和PX-12(116))(图27).其中,依布硒的抗病毒活性最佳,EC50为4.67μM[23].该团队随即解析了SARS-CoV-23CL蛋白酶与卡莫氟的复合物结构,揭示了卡莫氟的作用机制是通过共价酰化Cys145而抑制酶的活力,其脂肪链尾巴伸向了S2口袋.

图26SARS-CoV-23CL蛋白酶拟肽抑制剂的结构与抑制活性

SARS-CoV-23CLpro.

随后,Li等[131]报道了SARS-CoV-23CL蛋白酶与紫草素的复合物结构,发现紫草素中的萘醌基团位于催化级联的His41和Cys145之间,与His41形成π-π相互作用,整个分子占据底物结合区域的S1～S3口袋.

本课题组[132]与中国疾病预防控制中心谭文杰课题组合作发现草药黄芩的粗提物在体外抑制SARS-CoV-23CL蛋白酶活性,并且具有较好的抗病毒活性,EC50为0.74μg/mL.对于病毒感染的不同时间段加药发现,黄芩不仅可以抑制病毒的复制过程,还在一定程度上可以影响病毒的侵入.黄芩素(117)是黄芩中的主要成分,对SARS-CoV-23CL蛋白酶具有较好的抑制活性,IC50为0.39μM.本团队进一步鉴定了来自其他草药的多种黄芩素类似物,其中4种(118～121)化合物可在微摩尔浓度下抑制SARS-CoV-23CL蛋白酶活性.在同一时间,Su等[133]也报道了黄芩素和黄芩苷抑制SARS-CoV-23CL蛋白酶的活性,并通过复合物晶体结构测定发现了黄芩素的结合方式.黄芩素以非共价方式结合在SARS-CoV-23CL蛋白酶的S1和S2口袋,像盾牌一样阻止天然底物靠近催化中心.

本课题组[134]在前期工作基础上,考察了靛红类化合物对SARS-CoV-23CL蛋白酶的抑制活性,发现化合物51活性最佳,IC50为45nM.由于该类化合物具有细胞毒性较大的问题,仍需开展进一步的优化工作.

Douangamath等[135]通过基于片段的药物设计策略,采用质谱和蛋白质共结晶技术对含有1250个片段的化合物库进行SARS-CoV-23CL蛋白酶结合分子筛选.发现了71个结合在活性口袋的片段分子,其中有23个是非共价结合,48个是共价结合,另外还发现了3个结合在二聚界面的片段分子.在所发现的结合片段中,含有氯乙酰基的片段命中率最高.在命中的片段基础上进行组合或者延伸,以期得到新的分子可以与SARS-CoV-23CL蛋白酶形成尽可能多的相互作用.

图27SARS-CoV-23CL蛋白酶小分子抑制剂的结构与抑制活性

4、总结与展望

从2002年至今,不到20年的时间,已经暴发了三次由冠状病毒引起的人类感染重大疫情.除了流行病学的控制手段之外,开发针对性的特效药物同样十分重要.3CL蛋白酶在冠状病毒中高度保守,是病毒复制繁殖的关键酶,因此是一个理想的抗病毒药物设计靶点.虽然目前已报道的3CL蛋白酶抑制剂的结构类型比较丰富,但遗憾的是大部分化合物仅有体外酶活水平的数据,少部分在细胞水平表现出抗病毒活性的化合物活性也仅能达到亚微摩尔,仍需进一步的优化改进.其中,抗病毒活性较好、有研究前景的多为共价型肽类抑制剂,其通过与活性部位Cys残基形成共价作用而抑制酶的活力,在广泛应用后病毒可能会很快发生耐药突变,同时肽类化合物本身有不可避免的稳定性差、口服生物利用度低等问题.因此,具有新作用机制的高活性抑制剂亟需更多的研究.

3CL蛋白酶在溶液中存在单体与二聚体的平衡,在催化过程中二聚体为不对称结构,这种动态的结构变化及蛋白质二聚化对于酶催化活性的别构调控为基于结构的抑制剂设计特别是虚拟筛选带来了很大的挑战.目前已发现的针对3CL蛋白酶二聚体结合界面的多肽或分子片段活性均较低,针对3CL蛋白酶从病毒多聚蛋白中成熟过程的抑制剂尚没有报道.此外,3CL蛋白酶的C端非催化结构域功能尚不清楚,提示其在细胞内还有更多的非酶功能有待挖掘.近期的蛋白质组学研究发现SARS-CoV-23CL蛋白酶在细胞内可以与HDAC2发生作用[136],这种作用对于细胞生长状态以及病毒繁殖的影响都有待进一步研究.随着对于3CL蛋白酶催化活性调控机理、成熟机制及其非酶活性的进一步深入研究,以3CL蛋白酶为靶标的抗冠状病毒药物研发会有更大的突破.

李春梅,孙琦,陆阳彬,刘莹,来鲁华.冠状病毒3CL蛋白酶活性调控机制及抑制剂研究[J].中国科学:化学,2020,50(10):1250-1279.

基金:国家重点研发计划(编号:2016YFA0502303);国家自然科学基金(编号:21633001)资助项目.