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硅藻法医检验方法改进

2024-08-27 433 上传者：管理员

摘要：《法庭科学硅藻检验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662-2019）是目前法医硅藻学检验使用的标准方法，笔者在使用此方法检验过程中，发现存在组织消解不完全、硅藻碎片多、抽滤时间过长、滤过膜电热板烘烤后不平整、样本干燥度不够等问题。经过实验室的不断尝试，对检验过程的一些参数进行了调整，得到了较好的预期效果。改良方法通过添加恒温水浴锅和真空干燥箱两个基础设备，使各实验更容易实现。

关键词：
GA/T 1662-2019
多脏器
尸体溺死
检验
法医硅藻学
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法医硅藻检验技术是辅助判断水中尸体溺死的一种有效手段，通过在多脏器中检出硅藻来判断是溺水死亡还是死后入水。尸体组织器官的硅藻检验分为消解、富集、观察三个步骤进行，组织消解的方法很多，先后出现了强酸消化法、Soluene-350消化法、焚灼法、酶消化法、浸渍法、碎浆法，上述方法在实际操作过程中存在安全性较差、易造成污染、检出率低、硅藻形态结构破坏等缺点。近年来，使用中华人民共和国公共安全行业标准《法庭科学硅藻检验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662-2019）已成为硅藻检验的常规方法，此法具有高效、安全、环保、消解后的硅藻结构完整、具有较高的硅藻回收率[1]等优点。作者在实践检验过程中发现，按照规范标准方法操作，不同程度存在组织消解不完全、硅藻碎片多、抽滤时间过长、滤过膜电热板烘烤后不平整、样本干燥度不够等不足，直接导致电镜观察时视野不清晰、检验效率不高、电镜损耗高等问题。针对上述不足，作者经过多次实验，对标准方法进行了改进，通过预消解、降低消解温度、增加真空干燥等，获得了较为满意的实验结果。

1、材料和方法

1.1案例情况

选取某市公安局刑事科学技术研究所尸体1例，死因明确为溺死，未见其他疾病。

1.2样本制备

根据《法庭科学硅藻检验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662-2019）指引，取肾脏42 g，每个组织分取21份样本放于50 ml离心管中备用，提取前所有工具、器皿均用超纯水冲洗，确认不含硅藻。将21份检材分成A、B、C、D、E、F、G,7个组，每组3份组织。选取已知硅藻数量的水样，每个组织中加入2 ml水样进行消解[3]。

1.3硅藻检验

参照《法庭科学硅藻检验技术规范微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662-2019）对上述尸体的肺、肝、肾组织采用微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion-vacuumﬁltration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM）法进行硅藻检验。

1.3.1微波消解

将A、B、C组织置于消解罐内，加入8 ml 65%浓硝酸溶液（四川西陇科学有限公司）和2 ml 30%过氧化氢溶液（国药集团化学试剂有限公司），A组织直接置于微波消解仪中，B、C组织放于温度为50℃的水浴锅内进行预处理2 h后，放于微波消解仪中进行消解，组织消解参数设置为：工作功率1 000 W，工作压力30 kg/cm2，消解时间60 min，消解温度分别设为165℃。将D、E、F、G组织消解参数设置为：工作功率1 000 W，工作压力30 kg/cm2，消解时间60 min，消解温度分别设为160℃、165℃、170℃、180℃；消解完成后，降温60 min，取出消解管，向管内加入50 ml超纯水稀释消解的酸度。

1.3.2真空抽滤

将各组织消解液分别倒入Y500一次性真空抽滤杯内使用HL-6多联真空抽滤仪（珠海黑马医学仪器有限公司）进行抽滤（真空度400 mmHg），加入50 ml超纯水使滤膜表面接近中性。1.3.3滤膜干燥及称量

抽滤完成的滤膜用吸水纸吸干，进行滤膜称量。A、B、D、E、F、G组滤膜贴于样品座上，放于DZF型真空干燥箱（上海力辰邦西仪器科技有限公司）内，将压力调至0.06 MPa，温度调至50℃干燥2 h;C组滤膜放于可调式封闭电炉（上海科恒实业发展有限公司）上烘干。1.3.4扫描电子显微镜观察

应用SBC-12小型离子溅射仪（北京中科科仪股份有限公司）真空喷镀金膜后将样品座置于Phenom XL G2台式扫描电子显微镜（荷兰Phenom和World公司）下观察；参数设置为：加速电压10 v，图片像素为1024×1024、放大倍数为1000×、扫描率100%，共约2 733个视场，自动拍摄每个视场照片。每个样品座都由昆明市刑事科学技术研究所的2名具有丰富硅藻检验经验的法医学专家进行检验。计算硅藻含量（个/10 g）=组织检出硅藻数×10/组织质量，硅藻计数方法：肉眼观察记录硅藻数量及硅藻完整性，硅藻完整性如果不超过总体的2/3时计数硅藻碎片，硅藻完整性超2/3则计数为一个硅藻。

1.4统计学分析

使用SPSS 25.0软件（美国IBM公司）对数据进行统计学分析。硅藻含量以均数±标准差（±s）表示，数据服从正态分布和方差齐性使用两样本间t检验，不符合则使用秩和检验。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1未进行与进行预消解处理的电镜观察结果比较由图1～图4可以看出，经过预消解处理的组织比未进行预消解的组织消解更彻底，电镜背景更加干净，最终暴露的硅藻形态更加完整，更有利于硅藻的计数。图1未经预处理直接进行微波消解滤膜杂质含量较多，背景较模糊图2预消解处理后进行微波消解滤膜杂质含量较少，背景较清晰图3未经预消解直接进行微波消解，硅藻部分硅藻被杂质遮挡

图4预消解后进行微波消解，硅藻暴露程度、完整程度较好

2.2电炉干燥法和真空干燥箱干燥法观察结果

图5与图6比较可看出，由于干燥不均匀或贴膜不整齐而导致滤膜皱褶，在显微镜下观察图像呈模糊状态，无法观察硅藻的情况，从而影响硅藻的计数。

2.3不同消解温度对硅藻回收、抽滤时间及滤膜重量的影响

当消解时间固定时，硅藻回收的破碎数量和完整数量以及破碎数量占回收总数的比重在160℃、165℃、170℃和180℃之间有统计学差异（P<0.05）（表2），随着温度的升高，硅藻的破碎数量呈现增加趋势，破碎硅藻在回收硅藻的总数中的比重增加，从6%增长到39%。而硅藻的完整数量呈现下降趋势，160℃和165℃、170℃的硅藻完整回收数量之间不具有统计学差异（P<0.05）。故在160℃、165℃、170℃和180℃的消解下，温度越低硅藻的回收数量越好。抽滤时间在160℃、165℃、170℃和180℃之间有统计学差异（P<0.05）（表3），在160℃时所需的抽滤时间从28 min到180℃时仅需10 min，随着温度的升高，抽滤时间逐渐缩短。可见，随着温度的升高，消解越彻底，所需抽滤时间越短。滤膜重量在160℃、165℃、170℃和180℃之间有统计学差异（P<0.05）（表4),160℃的滤膜重量和165℃的滤膜重量之间不具有统计学差异（P>0.05);165℃和170℃、180℃的滤膜重量之间不具有统计学差异（P>0.05），随着温度的升高滤膜重量逐渐减轻，可见温度越高，滤膜上所富集的组织碎片就越少，消解能力就越强。

表1电炉干燥法和真空干燥箱干燥法电镜观察法比较T

图5电炉干燥后导致滤膜皱褶，滤膜表现出皱褶部分模糊不清

图6真空干燥箱干燥后滤膜平整，电镜扫描出的图像清晰

将图7～10进行比较可以得出：消解温度越低，滤膜上的杂质就越多，温度越高，滤膜就越干净。将图11～14进行比较可以得出：消解温度越高，硅藻破碎程度越高，温度越低，硅藻破碎程度越低，但部分杂质会阻挡硅藻，可能造成硅藻种类的误判或硅藻总量的减少。

表2硅藻回收数量随消解温度变化

表3抽滤时间随消解温度变化

表4滤膜重量随消解温度的变化

图7 160℃消解滤膜（SEM）滤膜上见较多杂质或不定性物质（可能为组织碎片）

图8 165℃消解滤膜（SEM）滤膜上杂质含量较160℃少

图9 170℃消解滤膜（SEM）滤膜上杂质含量较165℃少

图1 0 180℃消解滤膜（SEM）滤膜上几乎不见杂质

综合上述实验可以发现：（1）在进行组织硅藻检验前先进行预处理可以大大提高消解效率，减少滤膜杂质的覆盖率；（2）采用真空干燥法对滤膜进行干燥处理可以提高硅藻识别的清晰度，同时保护电镜；（3)165℃是我们进行硅藻消解的最适宜的温度。

3、讨论

采用微波消解-真空抽滤-显微镜法对硅藻进行处理，已经获得了行业认可，并成为了目前硅藻检验最常用的实验室方法[2,5]，在进行大量的实验操作后，笔者发现该方法可以进行细微的改进使其变得更加完善。首先，对组织进行预消解处理，处理过后的组织可以明显缩短抽滤时间，且组织消解会更加彻底，预消解采用的温度（50℃），不会对硅藻的完整性造成破坏，可以在具有较高的回收效率的同时，提高回收质量，提升了工作效率。其次，由于微波消解仪的工作原理是当微波通过样品时[5]，引起极性分子和带点离子伴随微波频率快速运动，而微波在加入过程中，可以使样品的各个部分同时产生热效应，加热快速、均匀，大大缩短了加入时间，提高能量利用率[6]，本研究发现了随着温度的升高，硅藻壳面分开或连接处完全断裂，导致了硅藻碎片增加，硅藻的回收数量从而出现随温度的升高而降低，在不同温度之间的硅藻回收数量差异较大，在设立的温度范围内，随着消解温度的增加，滤膜上的残留物质质量呈下降趋势，这说明当消解时间一定时，随着消解温度的增加，消解能力越强，滤膜上的残留物质呈减少趋势，所以最终选定了165℃为实验室设备的最适消解温度。最后，在干燥过程中，采用电炉干燥加热块烘烤滤过膜时，经常会出现滤过膜烘烤变形的情况，喷金后在电镜下出现图像不清、虚虚实实，大大降低了硅藻计数的准确性，且使用加热块烤干的滤过膜干燥程度不足，会造成扫描电镜真空泵损伤、灯丝使用寿命短，增加电镜的高昂维护费用。使用真空干燥箱干燥的方式，基本不会因为干燥导致滤过膜变形，平整的滤过膜在电镜下其能够获得更好的样品图像，增加清晰度。所以采用真空干燥的方式可以很好地避免以上所出现的问题，不仅提高了硅藻计数的准确性，也使电镜得到了较好的保护，延长电镜的使用寿命。

图1 1 160℃消解滤膜（SEM）硅藻被杂质覆盖包裹，使硅藻部分被阻挡，硅藻形态不能完全暴露

图1 2 165℃消解滤膜（SEM）硅藻形态完整，底部背景较干净，消解较适中

图1 3 170℃消解滤膜（SEM）硅藻形态部分被破坏，消解稍微过度

图1 4 180℃消解滤膜（SEM）硅藻形态大部分被破坏，消解过度

通过上述方法优化，实现了组织消解完全、杂质少、抽滤时间短、电镜扫描图像清晰质量高、硅藻形态结构完整等预期，增强了硅藻计数和种属分类的准确性，提高了检案效率。进行预处理及真空干燥的优化投入经费少，只需要增加水浴锅和真空干燥箱两个辅助设备，实验室比较容易实现。

参考文献:

[2]刘超.溺死法医诊断学[M].广州:中山大学出版社,2018:9.

[3]刘景建,杜宇坤,赵建,等.消解温度与时间对硅藻检验结果的影响[J].法医学杂志,2022, 38(1):77-80.

[4]赵健,胡孙林,刘超,等.硅藻检验方法综述[J].刑事技术,2012(2):44-46.

[5]礼晓明,李学金,礼跃.淡水中溺死血中K+,Cl-含量变化的实验研究[J].数理医药学杂志,2006, 19(2):2.

文章来源:王如武,张丽华,邱越,等.硅藻法医检验方法改进[J].中国法医学杂志,2024,39(04):492-495+499.