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长链非编码RNALINC00665对小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其作用机制

2020-09-05 378 上传者：管理员

摘要：目的:探讨长链非编码RNALINC00665在小细胞肺癌H446细胞中的表达,以及LINC00665高表达后对H446细胞增殖的影响。方法:以小细胞肺癌H446细胞系为实验组，非小细胞肺癌A549细胞系为对照组。应用实时荧光定量PCR方法检测H446和A549细胞中LINC00665的表达水平。通过病毒转染的方式，使H446和A549细胞中LINC00665高表达，分别检测H446和A549细胞中miR-186-5p的表达水平。病毒转染0、24、48和72小时后，采用MTT法检测H446细胞的增殖能力。结果:LINC00665的表达水平在H446细胞略低于A549细胞;给予相同数量的LINC00665高表达病毒分别转染后，miR-186-5p的表达水平在H446细胞略低于A549细胞，差异均没有统计学意义。与空白对照组和NC组相比，LINC00665高表达组H446细胞的增殖能力明显提高。结论:LINC00665可能通过调控miR-186-5p的表达，促进小细胞肺癌细胞的增殖。本研究有助于寻找小细胞肺癌潜在的治疗靶点，对提高小细胞肺癌患者的疗效具有积极意义。

关键词：
小细胞肺癌
肿瘤
长链非编码RNA
非小细胞肺癌
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肺癌是一种发病率和死亡率都较高的恶性肿瘤,严重影响人类的生命健康[1,2]。肺癌大致上可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌[3,4]。目前对于非小细胞肺癌的研究较多,抗肿瘤药物的不断出现,显著提高了非小细胞肺癌的治疗效果[5,6,7],但是由于小细胞肺癌独特的生物学性质,目前相关研究较少。因此,寻找小细胞肺癌潜在的治疗靶点,对提高小细胞肺癌患者的疗效具有积极意义。

肿瘤细胞发生异常增殖是恶性肿瘤的主要特征,也是一个涉及多种因素的复杂的调控过程[8,9]。近年来的研究显示,长链非编码RNA(long-chainnon-codingRNA,LncRNA)在肿瘤细胞的增殖过程中发挥着重要的调控作用[10,11]。LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,能够参与多种基因的表达调控[12,13]。LINC00665是一种长链非编码RNA,研究发现,对吉非替尼产生获得性耐药的非小细胞肺癌患者,LINC00665的表达水平显著升高。此外,在小鼠实验中,敲除LINC00665可以恢复对吉非替尼的敏感性,提示LINC00665可能是非小细胞肺癌潜在的治疗靶点[14]。此外,有研究指出,LINC00665可以通过下调miR-186-5p,进而上调MAP4K3,促进肝细胞癌的进展[15]。上述研究表明,LINC00665在多种肿瘤的发病过程中具有重要的调控作用,但目前在小细胞肺癌中相关研究较少。本文拟通过检测LINC00665在H446小细胞肺癌细胞中的表达情况,以及LINC00665高表达对H446细胞增殖能力和miR-186-5p表达水平的影响,初步探讨LINC00665在小细胞肺癌发病过程中的作用,为小细胞肺癌的诊断和治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞及试剂

H446细胞系和A549细胞系均购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,RPMI-1640培养基购自于美国Gibco公司,F12K培养基购自于美国Gibco公司,胎牛血清购自于美国Gibco公司,胰蛋白酶,青链霉素购自于美国Sigma-Aldrich公司,PrimeScriptTMRTMasterMix,TBGreenPremixExTaqTMII及引物购自于Takara公司。

1.1.2仪器

高速冷冻离心机(德国Eppendorf,5804R),超微量分光光度计(美国Denovix,DS-11FX+),实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD,CFX96Touch),多功能酶标仪(德国BMG,LABTECHPHERAstarFS)等。

1.2方法

1.2.1细胞培养

H446细胞:培养基和添加剂:RPMI-1640(Gibco,添加NaHCO31.5g/L,glucose2.5g/L,SodiumPyruvate0.11g/L),90%;优质胎牛血清,10%。气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度。

A549细胞:培养基和添加剂:F12K培养基(Gibco,添加NaHCO32.5g/L),90%;优质胎牛血清,10%。气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度。

1.2.2引物设计与cDNA制备

参考人源LINC00665及miR-186-5p在Genebank中的基因序列,选择同源性高的区域设计引物。LINC00665的上游引物序列为:5'-GAGGACTCAGAGGTGGAATT-3',下游引物序列为:5'-GACAGCCAGCTTGTAGGG-3';miR-186-5p的上游引物序列为:5'-GCGGATCCGAGCCATGCTTATGCTACTG-3',下游引物序列为:5'-GCGCGGCCGCCCAGGTATATGGCA-3'。Trizol试剂分别提取H446细胞和A549细胞的总RNA后,使用逆转录试剂盒合成cDNA,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行,-20℃保存备用。

1.2.3实时荧光定量PCR反应检测H446和A549细胞中LINC00665的表达

以cDNA为模板,进行实时荧光定量PCR扩增。第一步:在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中使双链DNA热变性(94℃、30s),第二步:引物与热变性生成的单链DNA退火(55℃、30s),第三步:在DNA聚合酶作用下合成互补链(72℃、1min);再返回步骤一,称为一个循环,每个循环后采集荧光生成扩增曲线,共40个循环。实验重复进行5次。

1.2.4LINC00665高表达病毒转染后H446和A549细胞中miR-186-5p表达的检测

将生长状态良好且处于对数生长期的H446细胞和A549细胞分别接种到96孔板,过夜培养,当细胞融合至50%时,给予相同数量的LINC00665高表达病毒进行转染,操作步骤严格按照说明书进行,建立稳定转染的细胞株。病毒转染后,H446细胞和A549细胞分别检测miR-186-5p的表达,方法同1.2.3。实验重复进行5次。

1.2.5LINC00665高表达病毒转染后H446细胞增殖能力的检测

取对数生长期的H446细胞,用胰酶消化成单细胞悬液,以每孔初始4000个细胞接种到96孔板中,分别构建LINC00665高表达组、NC组和空白对照组。96孔板置于培养箱中孵育,分别在转染0、24、48、72小时后,采用MTT法检测细胞的增殖能力。实验重复进行5次。

1.3统计学分析

使用SPSS21.0对数据进行统计学分析。Kolmogorov-Smirnov检验用于评估数据是否符合正态分布。基于检验结果,符合正态分布的连续变量用均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验,检验水准为α=0.05。

2、结果

2.1H446和A549细胞中LINC00665的表达

如图1所示,相比于A549细胞,H446细胞中LINC00665的相对表达量略低,但是两者间的差异不具有统计学意义(PH446=0.449),具体结果见表1。

图1H446和A549细胞中LINC00665的表达情况

表1H446和A549细胞中LINC00665的表达情况

2.2LINC00665和内参实时荧光定量PCR的特异性

如图2所示,LINC00665和内参的溶解曲线均为特异单峰,无其他杂峰,表明没有发生非特异性扩增反应,所设计的引物特异性较高,实验结果有效。

2.3LINC00665高表达后H446和A549细胞中miR-186-5p的表达

如图3所示,LINC00665高表达后,相比于A549细胞,H446细胞中miR-186-5p的相对表达量略低,但是两者间的差异不具有统计学意义(PH446=0.867),具体结果见表2。

图2LINC00665和内参的溶解曲线

图3LINC00665高表达后H446和A549细胞中miR-186-5p的表达情况

2.4miR-186-5p和内参实时荧光定量PCR的特异性

如图4所示,miR-186-5p和内参的溶解曲线均为特异单峰,无其他杂峰,表明没有发生非特异性扩增反应,所设计的引物特异性较高,实验结果有效。

2.5LINC00665高表达对H446细胞增殖的影响

H446细胞的增殖曲线见图5,采用MTT法检测细胞的增殖能力,与空白对照组和NC组相比,LINC00665高表达组H446细胞的增殖能力明显提高。

表2LINC00665高表达后H446和A549细胞中miR-186-5p的表达情况

3、讨论

肺癌已成为世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一[16,17],相比于非小细胞肺癌,小细胞肺癌目前主要的治疗手段仍然是化疗,但总体预后不佳。研究表明,相比邻近的正常肺组织,LINC00665在肺腺癌组织中明显上调,其表达水平与患者的临床病理特征密切相关[18]。LINC00665高表达的患者预后较差,而沉默LINC00665,则可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。因此,LINC00665可作为肺腺癌潜在的诊断标志物和治疗靶点[14]。

图4miR-186-5p和内参的溶解曲线

图5H446细胞的增殖曲线

研究发现,LINC00665可以通过下调miR-186-5p,进而上调MAP4K3,促进肝细胞癌的进展[15]。在非小细胞肺癌中,miR-186-5p可以抑制XIST的表达,降低XIST对细胞增殖和侵袭的促进作用[19]。此外,miR-186-5p能够靶向作用于SIX1,减弱SIX1对糖酵解基因的表达调控,从而抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进NSCLC细胞凋亡[20,21]。不仅如此,miR-186-5p还被报道在胃癌[22]、结直肠癌[23]、卵巢癌[24]及骨肉瘤[25]等恶性肿瘤中发挥抑癌作用。

上述研究证实,LINC00665和miR-186-5p在多种肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要的调控作用,miR-186-5p能够抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭,并促进NSCLC细胞凋亡[20,21],而LINC00665则可以通过下调miR-186-5p的表达促进肿瘤细胞增殖[15],但目前在小细胞肺癌中相关研究较少。本研究应用实时荧光定量PCR方法,检测H446和A549细胞中LINC00665的表达水平,以及LINC00665高表达对H446和A549细胞中miR-186-5p的表达水平及H446细胞增殖能力的影响。实验结果显示,LINC00665在H446细胞中同样存在高表达现象,并且外源性转染LINC00665高表达病毒后,H446细胞的增殖能力明显提高;此外,由于LINC00665可以通过下调miR-186-5p的表达促进肿瘤细胞增殖,而外源性转染LINC00665高表达病毒后,H446细胞与A549细胞中miR-186-5p的表达水平没有统计学差异。结合我们原创性的实验数据与相关文献,我们推测LINC00665可能通过抑制miR-186-5p的表达,促进小细胞肺癌的增殖和侵袭转移。

为了判定实验结果的可信性,各项实验均重复进行5次。总体而言,本研究具有较好的可重复性,实验结果稳定可信。但是本研究也存在一些局限性,第一,由于部分仪器和试剂供应商之间缺少一致的生产和检验标准,因此不同供应商生产的仪器和试剂可能对实验结果产生影响。第二,本研究的数据来源于对小细胞肺癌细胞系和非小细胞肺癌细胞系的检测,而不是肺癌患者的肿瘤组织,因此需要基于患者肺癌组织的相关实验,进一步验证本研究的结果。鉴于上述局限性,本研究得到的数据应该被审慎地解读。

综上所述,本研究发现LINC00665可能同样通过抑制miR-186-5p的表达,促进小细胞肺癌的增殖和侵袭转移。鉴于此,LINC00665有望成为小细胞肺癌潜在的治疗靶点,这对提高小细胞肺癌患者的疗效具有积极意义。

潘喜峰,马艳菊,唐域,于淼淼,王贺,范悦人,马天飞,赵舣航.上调LINC00665对小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其作用机制[J].现代肿瘤医学,2020,28(19):3284-3288.

基金:国家自然科学基金(编号:81602540);辽宁省自然科学基金(编号:2019-ZD-1025);辽宁省重点研发计划项目(编号:2017225055).