摘要:探讨miR-627-3p调控肺腺癌铁死亡的潜在机制。方法 纳入肺腺癌患者126例,收集肺腺癌组织和癌旁组织后使用miRNA微阵列检测差异miRNA并分析miRNA与肺腺癌患者生存率的相关性。过表达或敲低miRNA后检测肺腺癌细胞Calu-3的增殖水平和铁死亡水平。使用miRDB数据库分析miR-627-3p发挥生物学功能的潜在底物,选取评分最高的60个基因进行siRNA敲低筛选以鉴定miR-627-3p的底物。结果 miRNA微阵列分析发现有27种miRNA变化显著,其中14种miRNA在肺腺癌组织中表达下调,13种miRNA在肺腺癌组织中表达上调。其中,miR-627-3p高表达的肺腺癌患者生存率优于miR-627-3p低表达的肺腺癌患者。过表达miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平下降(P<0.05),铁死亡水平上升(P<0.05);敲低miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平上升(P<0.05),铁死亡水平下降(P<0.05)。敲低STK11或KEAP1时肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平下降(P<0.05)、铁死亡水平上升(P<0.05);过表达STK11或KEAP1时肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平上升(P<0.05)、铁死亡水平下降(P<0.05)。过表达miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平下降;敲低miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平上升。此外,miR-627-3p结合STK11或KEAP1的3’端非翻译区。结论 miR-627-3p通过并发靶向STK11/KEAP1促进肺腺癌的铁死亡水平。miR-627-3p可能是治疗肺腺癌的有用治疗靶点。
肺癌是癌症相关死亡的主要原因,是全球和中国最常见的癌症,导致2015年超过280万人死亡,其中约40%涉及肺腺癌(ADCs)[1]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC),包括ADC和鳞状细胞癌(SCC),分别占所有肺癌病例的80%~85%[2]。microRNA (miRNA)通过降解或抑制靶mRNA在转录后水平调节基因表达在肺腺癌发展和进展中具有重要作用[3]。此外,现在已知许多miRNA与癌症的发展和进展密切相关[4]。因此,在了解肺腺癌的分子机制以识别新的预后分子标志物方面面临着巨大的挑战,这些标志物可以促进在肺癌发展早期制定适当的治疗策略。细胞代谢的重编程,包括凋亡和坏死细胞死亡的调节,是肿瘤发生所必需的[5]。铁死亡是一种新发现的非凋亡性细胞死亡模式,涉及代谢功能障碍,导致细胞内代谢过程谷氨酰胺分解和铁依赖性活性氧(ROS)、铁载体蛋白转铁蛋白和线粒体超氧化物的产生,以及膜电位减少和其他相关调节剂的形成[6]。铁死亡水平异常与肿瘤发生发展密切相关[7]。基于此,本研究通过miRNA微阵列和体外细胞实验分析肺腺癌组织和癌旁组织中的差异miRNA对人肺腺癌细胞Calu-3铁死亡水平的影响。
1、材料与方法
1.1材料
纳入2019年1月至2021年12月我院收治的肺腺癌患者126例,其中男性75例,女性51例,平均年龄(51.23±22.59)岁。所有患者均经过我院病理科诊断并确诊为肺腺癌,并且均签署知情同意书且本研究获得我院的伦理委员会批准。收集患者治疗前的肺腺癌组织和癌旁组织后保存于液氮中。
miRvana总RNA分离试剂盒购自艾德科技公司(货号:AM1561)。GAPDH、STK11、KEAP1抗体购自abcam公司(货号:ab8245、ab15095、ab227828)。本研究所有的siRNA、miR-627-3p mimics、miR-627-3p inhibitor、STK11和KEAP1过表达质粒均由北京睿博设计合成。人肺腺癌细胞Calu-3购自广州群贤科技有限公司(货号:CTCC-003-0104)。PrimeScript RT Master Mix Kit购自广州翔博生物科技有限公司(货号:RR036A)。DCFH-DA购自北京依珊汇通科技有限公司(货号:D837204-50mg)。C11-BODIPY自深圳市益百顺科技有限公司(货号:GC40165-1mg)。pMIR-REPORT购自深圳市益百顺科技有限公司(货号:P0471)。
1.2方法
1.2.1细胞培养与处理
人肺腺癌细胞Calu-3在添加10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养,并将其置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中。
1.2.2 RNA抽取与实时荧光定量PCR
使用miRvana总RNA分离试剂盒分离总RNA,并根据制造商的说明使用NanoDrop分光光度计进行定量。然后将样品储存在-80℃直至使用。使用PrimeScript RT Master Mix Ki合成cDNA。采用Stem-Loop RT-PCR测定法检测miR-627-3p的表达。简而言之,使用实时PCR通用试剂和MX3000P实时PCR仪器根据制造商的说明进行实时PCR。PCR方案需要35个循环,即94℃1 min、55℃1 min和72℃1 min,然后在72℃延伸5 min。 将细胞和组织中的RNA水平标准化为U6 snRNA或GAPDH的水平。
1.2.3 MiRNA微阵列分析
使用安捷miRNA微阵列分析服务从三份肺腺癌组织和癌旁组织中检测miRNA表达谱。
1.2.4细胞增殖水平的测定
MTT法检测Calu-3细胞的增殖水平。用miR-627-3p mimics或inhibitor转染24 h后,将细胞以2×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。将10μL等分的MTT添加到每个孔中并孵育2 h,然后使用酶标仪测量490 nm处的光密度。
1.2.5细胞铁死亡水平的测定
Lipid-ROS水平为铁死亡指标之一。不同处理后,将Calu-3细胞与10μM DCFH-DA或5μM C11-BODIPY无血清培养基中于37℃孵育30 min。然后用PBS洗涤细胞。使用用于DCFH-DA荧光素检测的519 nm滤光片和用于C11-BODIPY检测的617 nm滤光片在流式细胞仪上分析ROS水平。
1.2.6免疫印迹
为了评估蛋白质表达,在裂解缓冲液中从1×106个Calu-3细胞样品制备全细胞裂解物,然后在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离含有60μg蛋白质的等分试样并电转移到PVDF膜。然后在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭膜1小时,并在4℃下与GAPDH抗体或STK11抗体或KEAP1抗体孵育过夜。随后,将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时。然后使用ECL试剂盒检测蛋白表达水平。
1.2.7荧光素酶报告实验
PCR扩增STK11或KEAP1 3'-UTR并克隆到pMIR-REPORTTM载体中。使用Lipofectamine 2000将50 ng pluc-3'UTR(WT或MT)、10 ng海肾萤光素酶、5 pmol miR-627-3p mimics和阴性对照的混合物共转染到Calu-3细胞中。48 h后,使用双荧光素酶报告分析系统分析荧光素酶活性。
1.3统计学分析
本研究使用R软件(版本:4.1.5)进行统计分析。非配对学生t检验检查组间差异的统计显著性。所有实验至少重复3次。对于多重比较,使用单因素方差分析,然后进行LSD事后检验。
2、结果
2.1肺腺癌组织中miR-627-3p高表达患者的生存情况
将126例患者的肺腺癌组织和癌旁组织各取33份混合在一起,随后进行miRNA微阵列分析,发现有27种miRNA变化显著,其中14种miRNA在肺腺癌组织中表达下调,13种miRNA在肺腺癌组织中表达上调。按照miRNA在肺腺癌组织中的平均表达水平,将126例患者分为miRNA低表达组和miRNA高表达组。发现miR-627-3p高表达的肺腺癌患者生存率优于miR-627-3p低表达的肺腺癌患者(P<0.05),见图1。
图1肺腺癌组织中miR-627-3p表达患者总生存期
2.2 miR-627-3p调控肺腺癌细胞的铁死亡
过表达miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平下降(P<0.05),铁死亡水平上升(P<0.05);敲低miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平上升(P<0.05),铁死亡水平下降(P<0.05),见图2。
图2 miR-627-3p调控肺腺癌细胞的铁死亡
2.3 miR-627-3p并发靶向STK11/KEAP1发挥生物学功能
使用miRDB数据库分析miR-627-3p发挥生物学功能的潜在底物,选取评分最高的60个基因进行siRNA敲低筛选。敲低STK11或KEAP1时肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平下降(P<0.05)、铁死亡水平上升(P<0.05);过表达STK11或KEAP1时肺腺癌细胞Calu-3的细胞增殖水平上升(P<0.05)、铁死亡水平下降(P<0.05),见图3A~图3C。预测STK11或KEAP1的miR-627-3p结合位点均位于3'端非翻译区。过表达miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平下降;敲低miR-627-3p后,肺腺癌细胞Calu-3中STK11或KEAP1的mRNA和蛋白水平上升,见图3D~图3F。将预测结合位点突变后,miR-627-3p无法结合STK11或KEAP1的3'端非翻译区,见图3G。
图3 miR-627-3p并发靶向STK11/KEAP1发挥生物学功能
3、讨论
肺腺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因,在过去几十年中发病率稳步上升[8]。因此,在了解肺腺癌的分子机制以识别新的预后分子标志物方面面临着巨大的挑战,这些标志物可以促进在肺癌发展早期制定适当的治疗策略。本研究发现miR-627-3p高表达的肺腺癌患者生存率优于miR-627-3p低表达的肺腺癌患者。因此,miR-627-3p可以成为肺腺癌患者预后的潜在标志物。
最近发现程序性坏死的铁死亡模式是一种不依赖细胞凋亡的细胞死亡形式[9]。铁死亡的特征在于脂质ROS的铁依赖性致死性积累[10]。miRNA介导中间代谢产物的感知,以调节基因调控和疾病进展,包括癌症[11]。然而,miRNA与铁死亡之间的联系仍不清楚。本研究证明miR-627-3p可以减少脂质ROS,减少了肺腺癌细胞铁死亡水平。
最近研究发现STK11和KEAP1与SCD1的表达存在相关性[12]。SCD1是1种已知的铁死亡调节剂[13]。SCD1的转录调控尚不完全清楚;然而,启动子区域包含几个众所周知的转录因子的转录因子结合位点,包括NF-1、AP-2、SREBP和PPAR[14]。STK11是1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能够磷酸化多种转录因子并促使转录因子核转移进行相关基因的转录[15]。KEAP1是1种泛素E3连接酶,能够通过泛素化调控多种转录因子入核[16]。因此,STK11和KEAP1可能对SCD1的关键转录因子进行了修饰,改变了SCD1的转录表达,改变了细胞的铁死亡水平。本研究结果首次表明miR-627-3p通过与STK11和KEAP1相互作用在癌变过程中充当重要的铁死亡抑制剂,miR-627-3p是1种新型的铁死亡调节因子。
肺腺癌的靶向治疗已在一部分肿瘤患者中取得成功,这些患者携带一些单一驱动突变,最显着的是导致致癌激酶激活的突变[17]。因此,这种方法不能为肿瘤具有更复杂的肿瘤突变谱的患者提供治疗策略,包括STK11和KEAP1突变[12]。鉴于基因的翻译区突变改变了蛋白质的构象减少了靶向治疗的效果,靶向治疗的关注点可以从蛋白水平转移到核酸水平,比如STK11和KEAP1的非翻译区。
综上所述,miR-627-3p作为抑癌因子发挥作用,以STK11和KEAP1依赖性方式抑制肿瘤细胞增殖、促进铁死亡。这些发现表明miR-627-3p是肿瘤进展的关键分子,可作为肺腺癌治疗的有效靶点。
参考文献:
[1]刘建,崔翰文,张雪梅,等.miR-17-5p在非小细胞肺癌患者中的表达及其与临床病理特征的相关性[J].中南医学科学杂志,2021,49(5):528-531,539.
[2]王娟,潘鑫,徐永茂.血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP联合对非小细胞肺癌的诊断价值[JUJ.中南医学科学杂志,2020,48(6)633-636.
文章来源:张苗苗,田君娜,孙颖颖.miR-627-3p并发靶向STK11/KEAP1调控肺腺癌的铁死亡研究[J].实用癌症杂志,2023,38(07):1066-1070.
在美国,预计2023年有238 340例新发肺癌病例,死亡127 070例[2]。肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因(占癌症总死亡人数的18%),造成了巨大的社会负担和经济损失[1,2]。大约80%的肺癌死亡是由吸烟引起的,其他危险因素包括氡气、石棉、长期接触空气污染(尤其是多环芳烃排放)以及家族肺癌病史[3,4]。
2024-04-09根据2020年全球癌症流行病学调查的结果,在恶性肿瘤的发病率中,肺癌位居第二,但死亡率最高,占所有癌症相关死亡人数的18%[1]。在非小细胞肺癌的早期阶段,手术仍然是主要的治疗方法。近年来,由于胸腔镜手术具有创伤较小、恢复时间短、手术视野清晰等优点,已逐渐取代了传统的开胸手术[2]。
2024-03-14肺磨玻璃结节直径通常在0.5~3 cm, 尺寸较小,形态因病变类型和性质而不同,通常呈现为肺组织内透明或半透明的小结节,肺部组织密度略高于周围正常肺组织的斑点或结节状阴影,但与实质性肺实质相比较透明[1],因其在影像中形似玻璃征,故称为“磨玻璃结节”。肺磨玻璃结节形成机制复杂,包括但不限于炎症、感染、肺部疾病、肿瘤、过敏性鼻炎和血管疾病等。
2024-03-10肺癌为临床常见的恶性肿瘤,近年患病人数持续增加,且发病群体趋于年轻化[1,2]。肺腺癌是最为常见的肺癌类型,原位肺腺癌与微浸润肺腺癌患者经根治性手术治疗后,疾病特异性生存率可接近100%,而浸润性肺腺癌患者预后则相对较差[3,4]。因此,探究影响浸润性肺癌患者手术治疗后预后的影响因素,对于临床尽早采取针对性干预、改善患者预后至关重要[5]。
2024-02-26肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤。2022年中国肺癌新增病例约87.1万,死亡人数约76.6万例[1]。肺腺鳞癌(adenosquamous carcinoma lung, ASC)是一种独特病理类型肺癌,约占所有肺癌的4%[2]。ASC包含了肺腺癌(adenocarcinoma of lung cancer, ADC)和肺鳞癌(squamous carcinoma of lung, SCC)的组成成分,但非ADC和SCC的混合[3],而是一种具有更复杂独特分子表型的肺癌。
2024-02-21免疫检查点抑制剂相关肺炎(immune check-point inhibitor associated pneumonia,CIP)是由免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)引起的一系列免疫相关不良反应(immune-related ad-verse events,irAEs)中临床、影像和病理表现各异的肺损伤,是引起ICIs相关死亡的重要原因之一。肺癌患者所有级别CIP发生率是其它肿瘤的1.658倍,3-4级CIP发生率是其它肿瘤的2.299倍,其中3-
2024-01-31含有Krab(Kruppel associated box)结构域的锌指蛋白-KRAB-ZFPs是人类转录抑制蛋白家族中数量最多的一类蛋白。它们参与很多重要的生理过程,包括细胞发育,增殖和凋亡的调控。ZNF23是近年发现的Krab结构锌指蛋白家族的一员。ZNF23基因位于染色体16q22[4,5],这一区域含有多种抑癌基因并在肿瘤发生时有突变,例如卵巢癌和子宫内膜癌[6,7]。它含有N端Krab结构域及C端C2H2锌指结构[8]。
2024-01-31肺癌是世界肿瘤患者发病率第二[1],死亡率第一的恶性肿瘤[2]。我国也是癌症发病和死亡第一大国[3],并且呈逐年上升趋势[4]。肺肿瘤分原发及继发两部分,原发肿瘤中非小细胞肺癌(NSCLC)约占80%~85%[4],同时,肺也是肿瘤的常见转移部位,约三分之一死亡的肿瘤患者出现肺转移[5]。
2024-01-10肺结节是指影像学上表现为≤3 cm孤立的或多发的局灶性、类圆形或不规则形、磨玻璃性、实性或亚实性、边界清晰或不清晰的肺部阴影,不伴胸腔积液、肺不张或肺门淋巴结肿大者。随着人们对健康需求和生活质量的提高,以及使用低剂量的胸部螺旋CT(LDCT)进行体检,肺结节检出率明显增高。
2023-11-25肺结节(pulmonary nodule,PN)是指影像学表现为直径≤3 cm的局灶性、类圆形、密度增高的实性或亚实性肺部阴影,可呈孤立性或多发性,不伴有肺不张、肺门淋巴结肿大和胸腔积液。肺结节有癌变风险,早期发现肺结节并对其进行监测干预,有利于控制肺结节的演变发展。
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