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探究转录组学分析及植物抗逆中转录组

2020-02-28 1104 上传者：管理员

摘要：限制植物生长发育的主要因素是逆境胁迫，植物研究的关键和难题便是对植物逆境胁迫的研究。研究基因转录调控的主要方法是发展转录组学，通过权重基因共表达网络分析探索模块与特定表型的关联关系，鉴定非生物胁迫以及生物胁迫基因网络。研究发现挖掘植物抗逆相关的基因，对解析植物抗逆机理具有重要意义。

关键词：
RNA测序
抗逆
生物胁迫
转录组学
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在特定条件下，细胞内所有转录产物的集合为转录组，包括编码RNA和非编码RNA两大部分。不断发展的现代生物学技术，使转录组学已成为后基因组时代一个强大的工具。不仅可以帮助理解基因结构和基于RNA的调节的任何生物体，而且是研究基因转录表达调控的重要手段，还有利于挖掘关键基因。使用RNA测序技术，首先是从所研究样品中提取总的RNA，通过逆转录转化为cDNA文库后进行测序，以得到改状态下的全部转录本信息，还可以检测细胞在单核苷酸水平上参与的转录活动，从而迅速且准确地对序列和表达量进行测定，以得到转录本的基本信息以及发现新转录本。还能够借助RNA-Seq技术识别单核苷酸多态性，研究基因结构变异，了解不同的可变剪切事件[1]。这些分析可以为全面揭示生物体生命活动中相关基因功能、系统发生与进化等提供帮助，为进一步揭示基因信息、挖掘新的基因和新基因的功能以及抗胁迫物种培育提供重要的基础。

1、转录组学的主要技术方法

随着科学技术的快速发展，使得转录组学的研究方法变得多样丰富，以解决转录组学中基因结构和基因功能这两大内容，基因结构和基因功能对研究生物体的生长发育以及抗逆等生物学过程有重要意义。转录组学技术主要是通过多种测序技术对研究物种某一状态下所有转录本进行测序，并整理和分析测序结果，得到该生物特定状态下的转录水平，并挖掘出关键的基因及其调控网络[2]。研究转录组学的不同技术方法可主要分为4类：即基于测序技术的转录组学；基于标签技术的转录组学[3]；基于杂交技术的转录组学以及基于PCR扩增技术的转录组学[4]。主要的分析技术有DNA微阵列技术、基因表达系列分析技术[5]、DNA宏阵列技术[3]、大规模平行测序技术[6]、cDNA文库或表达序列标签、DNA-AFLP技术[7]以及RNA测序技术等。RNA测序技术作为目前发展最为迅速的转录组学技术被广泛的应用，作为本文主要的讨论技术。相对比以上几种技术，RNA测序技术具有更高的灵敏度，适用于广泛的物种以及更好的重复性。

2、权重基因共表达网络分析

权重基因共表达网络分析是对转录组学的一个重要分析技术。WGCNA算法首先假定基因网络服从无尺度分布，并定义基因共表达相关矩阵、基因网络形成的邻接函数，然后计算不同节点的相异系数，并据此构建分层聚类树，该聚类树的不同分支代表不同的基因模块（module），模块内基因共表达程度高，而分属不同模块的基因共表达程度低。最后，探索模块与特定表型的关联关系，以达到鉴定基因网络的目的。

WGCNA一个重要目标是挖掘变量间的相关性，以及构建生物基因间的网络互作体系，发掘协同表达的module，通过分析关键基因并预测基因的功能[8-9]。现己在植物与病原菌互作、植物生长、组织器官发育等研宄领域进行应用。例如研究者利用RNA-seq分析了花青素敏感的苹果黄皮体细胞突变体和红果皮品种，共鉴定出3299个差异表达基因，差异表达基因的WGCNA分析发现34个基因的基因模块与花青素含量高度相关，甲基化实验结果显示MdMYB10启动子的甲基化是导致水果颜色差异的原因[10]。在猕猴桃细菌性溃疡病的研究中，研究者[11]利用RNA-Seq技术共鉴定出3582个环状RNA，利用WGCNA发现了一组与植物防御反应密切相关的CircRNAs。在无花果树中，研究者[12]研究了聚果榕在整个发育过程中以及白天和夜间释放的挥发性有机化合物的变化，WGCNA对挥发物进行分析，得到了7个不同的共同释放挥发性有机化合物模块，一些模块是聚果榕树对寄生蜂早期损伤响应为特征，主要由绿叶挥发物组成，其他模块响应传粉昆虫产卵或啃食植物组织，主要由假定的草食性诱导的植物挥发物组成。在镉胁迫下水稻根系转录组研究中，基于RNA-seq技术鉴定到1772个差异表达基因与激素信号和转录调控有关，结合WGCNA方法将271个差异表达基因参与镉调控，也是共表达模块的关键组成部分[13]。

3、转录组在植物抗逆中的研究

3.1 转录组在植物非生物胁迫中的研究

小麦幼苗根系低pH胁迫的转录组研究中，共鉴定出1057个差异表达基因，涉及免疫系统过程、发育过程、生物过程的正调控、多有机体过程和生物过程的代谢过程，并且发现WRKY转录因子在转录调控中发挥关键作用[14]。在橡胶树冷害的转录组研究中，研究者对4℃冷害处理2h和24h的样品进行RNA-Seq测序和基因表达分析，分别检测到1457和2328个差异表达基因，涉及植物激素信号转导、类黄酮生物合成、苯丙氨酸生物合成等途径[15]。在番茄冷害的长链非编码RNA的研究中，研究者共鉴定出1411个长链非编码RNA，其中239个具有显着的差异表达，靶基因包括氧化还原反应相关酶、细胞壁降解的重要酶、水杨酸和脱落酸代谢相关基因等，并且发现41种lncRNAs是33种miRNA的前体[16]。研究者运用全基因组高通量测序鉴定蒺藜苜蓿渗透和盐胁迫相关的长链非编码RNA，分别从渗透胁迫处理的叶片和根系样品中鉴定出7863和5561个长链非编码RNA，在盐胁迫处理的叶片和根系样品中，分别鉴定出7361和7874个长链非编码RNA，TCONS_00116877（长链非编码RNA）通过调节POD的表达参与调节植物对氧化应激的耐受性[17]。研究者[18]在玉米UV-B胁迫的转录组学研究中的结果表明差异表达基因的主要变化发生在细胞周期、转录调节、转录后修饰、植物激素等方面，赤霉素响应因子（GRFs）表达量发生变化导致赤霉素浓度的降低。研究者[19]利用转录组、microRNAs和降解组研究干旱胁迫后的泡桐，共鉴定出22904个差异表达的基因，2073个差异表达的miRNA和198个靶基因，其中14-3-3蛋白，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CTR1和多酚氧化酶与泡桐干旱胁迫直接或间接相关。

3.2 转录组在植物生物胁迫中的研究

研究者[20]在水稻枯萎病的研究中，利用RNA-Seq鉴定出1235个差异表达基因，涉及核糖体、苯丙素的生物合成途径；67个差异表达的转录因子和26个过氧化物酶反应基因，这些基因与疾病抗性机制有关。猕猴桃细菌性溃疡病的研究中，共发掘2726个差异表达基因，一些与抗病性相关的差异表达基因被发现参与了植物先天免疫反应、次生代谢和植物激素信号通路[21]。研究者对致病疫霉抗性和易感番茄进行比较转录组分析，鉴定到1037个差异表达基因和688个差异表达长链非编码RNA，其中lncRNA16397诱导SlGRX表达可以使得ROS的积累量下降并减轻细胞膜损伤，使得对致病疫霉的抗性增强[22]。甘蓝型油菜菌核病感染的转录组学研究中，研究者共鉴定931个长链非编码RNA响应于病原菌感染，表明它们在介导宿主对病原体的应答中发挥重要作用[23]。在香蕉枯萎病的转录组学研究中，研究者[24]获得了5294个长链非编码RNA，差异长链非编码RNA参与水杨酸、乙烯、茉莉酮酸和生长素信号转导。

4、展望

现代生物学技术的不断发展，研究者发现挖掘植物抗逆相关的基因，对解析植物抗逆机理具有重要意义。利用高通量测序技术，对某种植物抗逆基因信息进行全面分析，建立响应植物抗逆的转录组数据库，还能系统地分析抗逆基因表达谱，但是转录组的标准化分析流程获取的转录组数据量较大，基因的解析宽泛并且局限，关键基因的定位挖掘较难，可以利用WGCNA构建该植物的基因共表达网络，重点解析与抗逆具有较高相关性的模块，挖掘出植物抗逆的关键基因。转录组学在植物抗逆中的研究极大地推进了对探究植物病害分子机理，筛选最适生长环境，选育优良品种等都有重要意义。

参考文献：

[1]孙洪计,魏慧君.RNA-Seq技术在转录组研究中的应用[J].中外医学研究,2018,16(20):184-187.

[2]鞠正,曹东艳,梁岩,等.利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)的方法挖掘番茄果实成熟相关的转录因子[J].中国食品学报,2018,18(06):240-248.

李小凡,张雯宇,翟晓巧.转录组在植物抗逆中的研究[J].河南林业科技,2019,39(2):7-10.

基金项目:河南省科技创新杰出创新人才计划项目,项目编号:174200510001