毛细支气管炎是2岁以内婴幼儿特别是6个月以内婴儿易患的下呼吸道感染性疾病，临床表现以呼吸急促、喘憋貌、双肺哮鸣音为主，严重者可导致重症肺炎[1,2]。研究表明毛细支气管炎患儿最终有发展成哮喘的可能[3,4,5]。哮喘的反复发作不仅给患儿造成严重的生理及心理障碍，还给家庭造成一定的经济负担[6]。目前研究有部分疫苗可预防毛细支气管炎的发生，但是此类疫苗只针对一些有严重基础疾病及免疫缺陷的患儿[7]。近来研究表明人间充质干细胞因其低免疫原性及无MHC限制性的特点可用于大鼠及小鼠的多种疾病模型研究，并取得一定的效果。在LIU等[8]的研究中发现间充质干细胞可显著降低葡聚糖硫酸酯钠及2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠大肠炎症及坏死情况。还有研究表明，间充质干细胞的免疫调节作用是通过其分泌的外泌体实现的[9,10]，移植后8周在肺部仍能检测到间充质干细胞，其分泌的外泌体可持续存在6-8周的时间，作者推测其抗炎作用是否也同样持续存在，为此该实验旨在研究间充质干细胞预处理的小鼠是否对呼吸道合胞病毒感染导致的支气管炎症反应有一定防御作用，为预防毛细支气管炎的发生、发展提供理论依据。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验。

1.2 时间及地点

实验于2018年12月至2019年5月在滨州医学院附属医院临床医学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

选取6-8周龄雄性健康清洁级Balb/c小鼠40只，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司，于滨州医学院附属医院动物实验室SPF级动物房饲养，将40只小鼠随机分为4组：间充质干细胞预处理组、生理盐水预处理组、模型组、正常组，每组10只。所有实验均遵循国际实验动物护理和使用指南的建议，该方案经滨州医学院附属医院动物实验伦理委员会批准，实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.3.2 病毒、细胞

呼吸道合胞病毒(RSV)由山东省病毒研究所馈赠并由滨州医学院附属医院临床医学实验室冻存；人宫颈癌细胞(Hela细胞)由滨州医学院附属医院临床医学实验室冻存。

1.3.3 实验试剂

荧光标记的鼠抗人CD105-FITC、CD90-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD19-PE、CD34-FITC、C45-PE抗体(美国BioLegend公司)；40g/L多聚甲醛(Biosharp公司)；胎牛血清(四季青公司)；小鼠外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝公司)；兔抗鼠GATA3多克隆抗体(武汉三鹰公司)；小鼠白细胞介素4酶联免疫试剂盒(朗顿公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(索莱宝世纪有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 胎盘间充质干细胞制备与鉴定

选取滨州医学院附属医院产科健康产妇足月正常活产儿胎盘，产妇年龄25-30岁，并取得产妇及家属同意。参照张权等[11]方法提取间充质干细胞并培养，流式细胞术检测细胞表面CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45的表达，用无血清专用干细胞培养液传代培养胎盘间充质干细胞。

1.4.2 呼吸道合胞病毒悬液制备

复苏液氮冻存的Hela细胞，将冻存的呼吸道合胞病毒完全溶解后吸取50μL接种于已长满培养瓶的Hela单细胞层，当出现细胞致病变效应，且病变效应达70%-80%时，于-80℃冰箱反复冻融3次，4℃1000r/min离心10min，收集上清液，调整病毒滴度为1×106PFUs，移至新的冻存管于-80℃冰箱冻存备用。

1.4.3 胎盘间充质干细胞预处理

取第5代胎盘间充质干细胞悬液1mL(含细胞1×106个)通过尾静脉注射入间充质干细胞预处理组小鼠体内，生理盐水预处理组尾静脉注射等量生理盐水，模型组及正常组不做任何处理，同等条件于SPF级动物房喂养4周。

1.4.4 呼吸道合胞病毒感染小鼠模型制备

参照李雅慧等[12]的模型制备方法。喂养4周后，除正常组外，其余3组均用100μL呼吸道合胞病毒(1×106PFUs)悬液滴鼻法滴入小鼠两侧鼻内，正常组用100μL生理盐水鼻内滴入，1次/d，连续滴2d，末次滴鼻24h后观察各组小鼠咳喘、口周及四肢末梢发绀情况，毛细支气管炎小鼠模型制备完毕。

1.4.5 ELISA法检测小鼠血清白细胞介素4水平

于末次激发后24h，各组随机选取3只小鼠，充分麻醉后采用摘除眼球法留取血液1mL，肝素抗凝，800r/min离心5min，留取上层血清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中白细胞介素4水平。

1.4.6 苏木精-伊红染色法观察各组肺组织病理变化

于末次激发后24h，各组随机选取3只小鼠，5%水合氯醛腹腔注射，充分消毒后无菌解剖胸腹腔，暴露肝脏、肺脏、心脏，用一粗针头插入左心室并固定，连接恒流泵，迅速剪下右心耳，生理盐水灌洗，可看到右心耳有新鲜血液流出，待肺脏及肝脏变白，右心耳流出清亮不带血色液体后再用40g/L多聚甲醛灌洗，待肝脏变韧，肺脏膨胀，边缘变钝说明灌洗成功，小心分离解剖肺组织，留取右肺中叶进行固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡，苏木精-伊红染色、封固，400倍光镜下观察各组小鼠肺组织病理学变化，请滨州医学院附属医院病理科3名经验丰富的医师阅片，分析结果。

1.4.7 Westernblot法检测肺组织GATA3蛋白表达

于末次激发后24h，各组随机选取4只小鼠，同样方法小心解剖小鼠，用生理盐水充分灌洗后留取肺组织右肺中叶，提取肺组织总蛋白，BCA法测量蛋白浓度，上样量为50mg，按4∶1比例加蛋白上样缓冲液，沸水煮10min,-20℃冰箱贮存备用(用之前再煮5min)。依次按照碧云天凝胶配制试剂盒说明书配胶、加样本蛋白及mark、电泳(80mV30min,100mV60min)、转膜(200mA120min)，于7%脱脂奶粉中封闭3h，加兔抗鼠GATA3多克隆抗体(1∶300)4℃过夜，TBST清洗3次，加二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG1∶5000),TBST清洗3次，于凝胶成像仪曝光成像，用ImageJ软件分析数据。

1.5 主要观察指标

各组小鼠血清白细胞介素4水平、肺组织病理变化和肺组织GATA3蛋白表达。

1.6 统计学分析

实验所有数据均采用SPSS22.0软件系统进行分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析、独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 人胎盘间充质干细胞形态及鉴定结果

胎盘间充质干细胞均呈贴壁生长，流式细胞仪检测发现细胞表面标记物CD105、CD90、CD44、CD73呈高表达，阳性率在97%以上，而CD19、CD34、CD45的表达量甚微，阳性率仅在3%以下。符合国际细胞疗法协会所制定的间充质干细胞表面免疫标记物的鉴定标准[13]。

2.2 各组小鼠一般情况

模型组在末次滴鼻24h后出现明显的咳喘、口周及四肢末梢发绀情况，活动力减弱，体毛无光泽；正常组无明显症状；间充质干细胞预处理组上述症状明显减轻；生理盐水预处理组无明显改善。该病毒量刺激下暂无小鼠死亡情况。

2.3 ELISA法检测血清中白细胞介素4水平

模型组白细胞介素4水平较正常组明显增高[(82.66±5.33)ng/Lvs.(24.52±3.35)ng/L]，差异有显著性意义(P<0.01)；间充质干细胞预处理组白细胞介素4水平较模型组明显降低[(36.73±6.66)ng/Lvs.(82.66±5.33)ng/L]，差异有显著性意义(P<0.01)；生理盐水预处理组与模型组无明显差异[(82.92±4.55)ng/Lvs.(82.66±5.33)ng/L,P>0.05]。

2.4 苏木精-伊红染色分析结果

正常组：无明显炎症改变，肺泡及支气管结构正常；模型组：较正常组有明显的炎症改变，包括上皮细胞坏死，黏膜下充血、水肿及腺体增生，支气管气道直径较正常组变窄，气道上皮黏膜增厚，周围炎症细胞浸润明显；生理盐水预处理组：该组小鼠毛细支气管炎症状及肺组织炎症无明显改善；间充质干细胞预处理组：较模型组肺部炎症减轻，支气管及肺泡结构破坏明显减轻，黏膜下充血、水肿情况明显减轻，气道周围炎症细胞减少，气管黏膜增厚明显减轻，见图1。

图1|肺组织病理改变(苏木精-伊红染色，×400)

2.5 各组小鼠肺组织GATA3蛋白表达

与正常组相比，模型组肺组织GATA3表达明显增多，差异有显著性意义(P<0.01)；生理盐水预处理组与模型组比较差异无显著性意义(P>0.05)；间充质干细胞预处理组GATA3表达较模型组明显减少，差异有显著性意义(P<0.01)，见图2。

图2|Westernblot法检测各组肺组织GATA3蛋白表达

3、讨论

毛细支气管炎是2岁以下特别是6个月以内婴幼儿常见的下呼吸道炎症，主要由呼吸道合胞病毒感染引起。毛细支气管炎的主要症状是呼吸急促、喘憋貌、气道高反应性及气道炎症表现[6]。SIGURS等[14]研究发现该病毒感染后并不能获得终身免疫，且反复感染与日后形成哮喘及过敏性疾病密切相关，所以患儿一旦感染该病毒可能对身体产生较长时期的影响。呼吸道合胞病毒是导致毛细支气管炎的主要病原体，且比其他病毒感染导致更严重的炎症反应[15,16]。PINTO等[17]报道称呼吸道合胞病毒感染后可导致体内T淋巴细胞比例失衡，并向Th2型免疫反应极化，Th1细胞产物减少，Th2细胞产物如白细胞介素4增多。GATA3是最近发现的调控细胞分化及相关细胞因子产生的重要蛋白，是Th2类细胞因子的特异性转录因子[18]，影响Th2类细胞产生白细胞介素4等细胞因子，在COLLEY等[19]研究中发现严重哮喘患者血清中白细胞介素4显著增多，且与GATA3呈正相关。张雪静等[20]研究发现毛细支气管炎组小鼠GATA3及白细胞介素4的表达明显高于正常组，表明GATA3及白细胞介素4水平与毛细支气管炎的严重程度有关。该实验研究证明模型组小鼠体内白细胞介素4及GATA3水平明显高于正常组，该结果与上述结论一致，表明呼吸道合胞病毒感染可能通过GATA3的过表达来增强Th2类细胞及其细胞因子的产生，进而增强炎症反应。

间充质干细胞属于干细胞中的成体干细胞，具有高度自我增殖和多向分化潜能，其应用于肺部疾病研究的优势包括低免疫原性、来源丰富、具有免疫调节的作用[21],LI等[22]报道称经静脉输注间充质干细胞后其首先的归巢脏器是肺脏，这为移植间充质干细胞治疗肺部疾病的研究提供了理论基础，且体外实验表明间充质干细胞外泌体有削弱细胞凋亡的作用[23]。ROYCE等[24]研究表明间充质干细胞经鼻滴入可显著降低气道高反应性，并有一定的抗纤维化和抗炎作用。该实验研究表明间充质干细胞预处理组较模型组小鼠体内GATA3及白细胞介素4的表达明显降低，且肺部炎症明显减轻，说明间充质干细胞预处理后可减轻小鼠感染呼吸道合胞病毒后毛细支气管炎的炎症反应。ARSLAN等[25]研究表明预先输注间充质干细胞可显著降低心肌缺血再灌注后的炎症损伤，有预防炎症的作用。该实验结果表明预先输注间充质干细胞可显著降低呼吸道合胞病毒致毛细支气管炎的炎症反应，降低T淋巴细胞失衡，与上述实验结果一致。

在LEE等[26]研究中提到，间充质干细胞分泌的外泌体有抗肺血管平滑肌增殖的作用，并表明间充质干细胞在预防肺损伤及肺血管重构方面发挥重要作用，研究表明间充质干细胞外泌体可改善低氧诱导的肺损伤，减轻肺血管重构，指明了间充质干细胞外泌体充当介质的作用，这均说明了间充质干细胞外泌体不但具有治疗作用，还有预处理后的预防作用。XU等[27]研究表明间充质干细胞可以预防博来霉素和内毒素诱导肺损伤小鼠模型的肺部炎症、肺水肿反应，并能减少炎症因子的产生，说明间充质干细胞可以预防或减轻肺损伤的发生。金志贤等[28]研究表明腹腔移植间充质干细胞可抑制肺气肿模型大鼠的肺部炎症，并能够下调血清及肺组织中炎症因子的表达，在移植8周后可以在肺组织中观察到间充质干细胞，这说明间充质干细胞可以在体内存留较长时期，为其预防肺部炎症作用打下基础。汪珺等[29]研究表明髓系抑制细胞可促进血管生成，而骨髓间充质干细胞可抑制髓系抑制细胞的活化与增殖，进而起到抑制肿瘤转移的作用，因此可推测间充质干细胞通过抑制血管的生成来抑制炎症反应。杨红霞等[30]研究发现移植人脐带间充质干细胞可显著减轻哮喘小鼠肺组织的炎症反应，减轻杯状细胞增生及相应炎症因子的释放。以上研究均说明了间充质干细胞不仅具有对炎症反应的治疗作用，还具有一定的预防作用。该研究设立了人胎盘间充质干细胞预处理组和正常组小鼠对比，两组小鼠各项检查指标差异均无显著性意义(P>0.05)，说明对正常小鼠肺组织无影响。

该实验研究表明，经过人胎盘间充质干细胞预处理后的小鼠在感染呼吸道合胞病毒时，其症状及肺部炎症改变均较生理盐水预处理组明显减轻，且反映毛细支气管炎严重程度的GATA3及白细胞介素4表达明显低于生理盐水预处理组。通过以上研究发现胎盘间充质干细胞预处理可降低小鼠近期因呼吸道合胞病毒感染导致的毛细支气管炎症状，并降低其肺组织炎症反应程度。该方案有可能为预防小儿毛细支气管炎提供新的思路。

参考文献：

[3]王执勇,李树青,钱秀玲.孟鲁司特治疗呼吸道合胞病毒毛细支气管炎症状及反复喘息疗效研究[J].中国全科医学,2020,23(8):929-934.

[6]朱其国,袁林,林建成,等.毛细支气管炎患儿血IL-4､IL-10､IL-17的变化及意义[J].中国妇幼健康研究,2020,31(5):649-652.

[11]张权,张亚奇,饶巍,等.长期传代培养对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响[J].中国细胞生物学学报,2019,41(1):42-52.

[12]李雅慧,张国成,许东亮.雾化吸入干扰素α-1b对呼吸道合胞病毒治疗的实验研究[J].西北国防医学杂志,2010,31(3):203-205.

[16]彭程,黎金雨,赵云,等.呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿中TREM-1/DAP12通路关键信号节点的表达[J].中国感染控制杂志,2020,19(5):433-439.

[18]沈朝斌,郁兰,顾燕妮,等.体内转染黄芪来源miR-396可抑制哮喘小鼠Th2细胞的GATA-3表达[J].中国免疫学杂志,2019,35(24):3001-3007.

[20]张雪静,何潇,吴福玲,等.心房钠尿肽对毛细支气管炎小鼠肺组织GATA-3的调控[J].中国免疫学杂志,2018,34(10):1461-1465.

[21]张恒爱,梅花,刘春枝.间充质干细胞及其外泌体防治支气管肺发育不良研究进展[J].中华新生儿科杂志(中英文),2020,35(3):232-235.

[28]金志贤,王清,郭翔,等.间充质干细胞移植肺气肿大鼠肺组织病理改变及炎性因子表达变化[J].山东医药,2015,55(15):20-22.

[29]汪珺,苏晓三,杨柳,等.骨髓间充质干细胞预防手术后肿瘤肺转移动物模型研究[J].中国癌症杂志,2017,27(2):89-94.

[30]杨红霞,石清红,翁敏华,等.人羊膜间充质干细胞移植对哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏蛋白5ac表达的影响[J].中国组织工程研究,2019,23(25):4050-4055.

史洋洋,秦英飞,吴福玲,何潇,张雪静.胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J].中国组织工程研究,2021,25(07):991-995.

基金:山东省自然科学基金(ZR2014HL001),项目负责人:吴福玲;山东省医药卫生科技发展项目(2013WS0312),项目负责人:吴福玲;山东省滨州市软科学研究计划(2016BRK19),项目负责人:吴福玲.