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罗布麻叶总黄酮对高脂血症大鼠的降脂作用研究

2021-01-28 226 上传者：管理员

摘要：目的：观察罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠的降脂作用。方法：将SD大鼠随机分成对照组、模型组、辛伐他汀组（5mg•kg-1）及TFA低、中、高剂量组（26、52、104mg•kg-1），每组8只。以高脂饲料喂养4周建立高脂血症大鼠模型。大鼠在造模同时予以相应药物连续灌胃给药，每天1次，给药体积为10mL•kg-1，对照组和模型组予以等量0.5%CMC-Na溶液。采用苏木素-伊红（HE）染色观察肝组织病理学变化；测定血清和肝组织的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、一氧化氮（NO）水平，计算血脂综合指数（LDL-C/HDL-C）及动脉硬化指数（AI）；测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）含量；采用ELISA法检测血清血管紧张素-II(Ang-II）、血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1）水平。结果：与正常组比较，模型组大鼠的肝组织脂肪变性明显，血清和肝脏的TC、TG、LDL-C水平显著升高（P<0.01),HDL-C、NO水平显著降低（P<0.05,P<0.01),LDL-C/HDL-C、AI指数明显升高（P<0.01），血清Ang-II、VCAM-1及MDA水平均明显升高（P<0.01），血清SOD活性明显降低（P<0.01）。与模型组比较，TFA各剂量组大鼠的肝脏脂肪变性程度明显降低，TFA高剂量组大鼠血清和肝脏组织的TC、TG、LDL-C水平明显降低（P<0.05,P<0.01),HDL-C、NO水平显著升高（P<0.01),LDL-C/HDL-C及AI指数明显下降（P<0.01），血清Ang-II、VCAM-1及MDA水平明显降低（P<0.05,P<0.01），血清SOD活性明显升高（P<0.01）。结论：罗布麻叶总黄酮对高脂血症大鼠有明显的降血脂和降肝脂作用，能减轻高血脂导致的血管内皮损伤和改善体内氧化应激水平，实现对血脂代谢的调节。

关键词：
氧化应激
罗布麻叶总黄酮
血管内皮损伤
降脂作用
高脂血症
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罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的干燥叶，是一味传统的平肝清热中药，含有鞣质、黄酮、有机酸、脂肪酸醇脂、氨基酸等多种化学成分，罗布麻叶提取物具有肝保护、抗氧化、降压、降血脂等多种药理作用[1]。黄酮类成分是罗布麻叶的主要活性成分之一，具有抗抑郁、保肝、降血压、降血脂等功效[2]。研究[3]表明，罗布麻茶能降低大鼠血清总胆固醇及甘油三酯含量，提高高密度脂蛋白胆固醇的含量，具有降血脂的功效。罗布麻叶鞣质和黄酮有效部位均能够调节血脂、抗氧化，改善动脉粥样硬化（AS）早期病变[4]。黄酮类化合物是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基，改善血液循环，降低胆固醇，降低心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状[3]。故本研究拟通过高脂饲料喂养复制高脂血症（Hyperlipidomia,HLP)SD大鼠模型，观察罗布麻叶总黄酮（TFA）的体内降血脂、降肝脂、保护血管内皮损伤及氧化应激的调控作用，全面评价TFA对高脂血症脂代谢紊乱的调节作用。

1、材料与方法

1.1动物

雄性SD大鼠48只，SPF级，体质量（180±20)g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：44002100020701，动物生产许可证号：SCXK（粤）2016-0041。动物饲养于广州中医药大学中药学院动物房SPF级环境，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2019-0202。

1.2药品及试剂

罗布麻叶，购自广东和翔制药有限公司，批号：HX18A01，经广州中医药大学中药学院张丹雁教授鉴定为夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的叶；辛伐他汀片，上海信谊万象药业股份有限公司。高脂饲料（成分：3%胆固醇、10%猪油、5%白糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、81.3%基础饲料），由广东省医学实验动物中心提供。芦丁，中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707；羧甲基纤维素钠、HPD-500型大孔树脂，均购自广州苏铖粤贸易有限公司；脂肪专用固定液，批号：HP192102，武汉赛维尔生物科技有限公司；甘油三酯（TG，批号：201909016）、总胆固醇（TC，批号：20190924）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，批号：20190905）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，批号：20190905）、一氧化氮（NO，批号：20190904）、总超氧化物歧化酶（T-SOD，批号：20191016）、丙二醛（MDA，批号：20191031）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；血管紧张素-II(Ang-II，批号：J22013320）、血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1，批号：I30013321)ELIASA试剂盒，均购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3主要仪器

AL204型分析天平，瑞士MettlerToledo公司；酶联免疫检测仪、STP120型脱水机、HistoStar组织包埋机、HM340E型石蜡切片机，美国ThermoFisher公司；5417R型台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HY-4型调速多用振荡器，江苏金坛市宏华仪器厂；WFZ-UV-2100型紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；SII-N14B型电热恒温水浴锅，北京精科华瑞仪器有限公司；SB25-12DTD型超声清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.4TFA的制备

取罗布麻叶适量，用10倍量70%乙醇浸泡24h；共用70%乙醇提取3次，每次2h；收集所有滤液，浓缩至无醇味；静置2h，抽滤后将沉淀水洗3遍，合并滤液。参考文献[5]报道的纯化工艺参数，采用HPD-500型大孔树脂进行纯化，纯化后的总黄酮提取液浓缩干燥后得到TFA粉末，总黄酮提取率为4.19%。

以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，采用紫外-可见分光光度计，在510nm波长处测定吸光度，以吸光度值（Y）为纵坐标，芦丁对照品溶液浓度（X）作为横坐标，绘制标准曲线，结果表明芦丁在0.01～0.05mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系，回归方程为：Y=11.99X-0.0117(n=5,r=0.9990），计算得TFA质量分数为75.9%。

1.5分组及给药

SD大鼠经过1周的适应性喂养后，根据随机分组方法[6]分为6组，即对照组、模型组、辛伐他汀组及TFA低、中、高剂量组，每组8只。大鼠自由饮水，对照组给予基础饲料喂养，其余5组大鼠以高脂饲料连续喂养4周。从造模的第1天开始给药，TFA低、中、高剂量组（26、52、104mg·kg-1，为成人临床剂量的0.5、1、2倍）、辛伐他汀组（5mg·kg-1）按剂量灌胃给药，每天1次，给药体积为10mL·kg-1，连续灌胃4周；对照组和模型组予以等量0.5%CMC-Na溶液灌胃。

1.6血清生化指标检测

末次给药后，大鼠禁食不禁水12h后，空腹麻醉下进行腹主动脉取血；血液在室温下静置1h后，4℃、3800r·min-1离心15min，取血清，分装后于-20℃保存。取部分血清，根据试剂盒说明书步骤测定各组大鼠血清中的TG、TC、LDL-C、HDL-C、NO、SOD和MDA水平；计算血脂综合指数（LDL-C/HDL-C）和动脉硬化指数（AI),AI=(TC-HDL-C）/HDL-C。

1.7ELISA法测定血清Ang-II、VCAM-1水平

取部分血清，按试剂盒说明书步骤采用ELISA法测定各组大鼠血清Ang-II和VCAM-1含量。首先根据标准品的浓度及光密度（OD）值在专业软件CurveExpert中制作标准曲线，再根据样本OD值，通过回归方程计算出对应的样品浓度。

1.8肝组织生化指标检测及病理学观察

取血后处死大鼠，迅速取出肝组织。取部分肝组织，按试剂盒说明书步骤测定肝脏的TG、TC、LDL-C、HDL-C和NO水平。另取部分肝组织，用脂肪专用固定液固定，经修整后用常规石蜡包埋，均匀切片，采用苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肝组织脂肪变性程度。

1.9统计学处理方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示；进行正态性及方差齐性检验，若满足正态性及方差齐性则多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD检验，若方差不齐则采用Dunnett’sT3法，不符合正态分布的数据比较采用非参数Mann-WhitneyU检验；以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1TFA对高脂血症大鼠肝组织病理形态的影响

结果见图1。对照组大鼠未发现肝细胞脂肪变性及坏死，肝细胞内无脂滴分布，肝窦清晰可见，肝索排列整齐。模型组大鼠肝脏出现严重的细胞脂肪变性，肝细胞增大，细胞质内出现大量大小不一的空泡状脂滴，将细胞核挤向细胞边缘，肝窦受压变窄，肝索排列紊乱。与模型组比较，TFA低、中、高剂量组的大鼠肝细胞脂肪变性程度逐渐降低，胞浆内脂滴空泡减少，脂滴泡变小，尤其是高剂量TFA作用下的肝细胞，得到了较大改善；辛伐他汀组大鼠肝细胞脂肪变性程度明显降低，胞浆内脂滴空泡减少，但仍可见大脂滴。结果表明，TFA能够降低高脂血症大鼠的肝组织脂肪变性程度。

图1各组大鼠的肝脏组织病理形态学观察（HE染色，×100)

2.2TFA对高脂血症大鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平的影响

结果见图2。与对照组比较，模型组大鼠血清的TG、TC以及LDL-C水平明显升高（P<0.01),HDL-C水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较，TFA中剂量组的大鼠血清LDL-C水平明显降低（P<0.05),HDL-C水平明显升高（P<0.05);TFA高剂量组和辛伐他汀组的大鼠血清TG、TC和LDL-C水平明显降低（P<0.05、P<0.01),HDL-C水平明显升高（P<0.01）。其中，TG、LDL-C和HDL-C在TFA各剂量组间呈现一定的剂量依赖关系。结果表明，TFA能够改善高脂血症大鼠血液中的脂质代谢。

图2罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C水平的影响

2.3TFA对高脂血症大鼠血清LDL-C/HDL-C及AI的影响

结果见图3。与对照组比较，模型组大鼠血清的血脂综合指数（LDL-C/HDL-C）和动脉硬化指数（AI）均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，TFA中、高剂量组及辛伐他汀组的大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI指数均明显降低（P<0.05,P<0.01）。结果表明，TFA通过改善血脂代谢紊乱，对动脉粥样硬化也有一定的治疗作用。

图3罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI指数的影响

2.4TFA对高脂血症大鼠肝组织中TG、TC、HDL-C、LDL-C、NO水平的影响

结果见图4。与对照组比较，模型组大鼠肝组织的TG、TC和LDL-C水平明显升高（P<0.01),HDL-C和NO水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较，除TFA中剂量组大鼠的肝组织TC、NO水平以及低剂量组大鼠肝组织的HDL-C水平变化不明显（P>0.05）之外，各给药组大鼠肝组织的TG、TC和LDL-C水平均明显降低（P<0.05、P<0.01），肝组织的HDL-C、NO水平均显著升高P<0.05,P<0.01）。结果表明，TFA能够改善高脂血症大鼠肝组织的脂质代谢和NO水平。

图4罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠肝组织中TG、TC、LDL-C、HDL-C及NO含量的影响

2.5TFA对高脂血症大鼠血清NO、Ang-II及VCAM-1水平的影响

结果见图5。与对照组比较，模型组大鼠的血清NO水平明显降低（P<0.05),Ang-II和VCAM-1水平明显升高（P<0.01）。与模型组比较，TFA中、高剂量组和辛伐他汀组大鼠血清的NO水平明显升高（P<0.01);

图5罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠血清NO、Ang-II及VCAM-1水平的影响

2.6TFA对高脂血症大鼠血清SOD、MDA的影响

结果见图6。与对照组比较，模型组大鼠的血清SOD活力明显降低（P<0.01),MDA水平明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠的血清SOD活力均明显升高（P<0.05,P<0.01);TFA高剂量组和辛伐他汀组大鼠的血清MDA水平明显降低（P<0.05）。结果表明，TFA可能通过减少血清MDA和增加SOD活性来改善高脂血症大鼠体内的氧化应激。

图6罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠血清SOD、MDA水平的影响

3、讨论

高脂血症（hyperlipidomia,HLP）是一种脂质代谢紊乱性疾病[7]，由于全身脂肪代谢紊乱引起血液中1种或几种脂质结构失衡，其中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）是评价血脂水平的常用指标。TG、TC和LDL-C升高以及HDL-C降低，可导致血管内皮受损，加速脂质在血管的皮下沉积，促进动脉粥样硬化（AS）的形成。在AS的形成过程中，血管紧张素-II(Ang-II）和血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1）起了重要作用，Ang-II能直接作用于血管壁引起血管收缩，促进平滑肌细胞增殖及血管重构[8];VCAM-1早期表达会促使白细胞和巨噬细胞的活动性、黏附力和转移力增强，导致单核细胞转化成巨噬细胞，摄取脂质转化为泡沫细胞，进一步促进血管内皮损伤[9]。当血管内皮受损时，NO合成和释放减少，增加机体脂质过氧化反应，其终产物如丙二醛（MDA）可导致经修饰的蛋白质和酶失去活性，引起代谢及细胞膜功能异常[10]。此外，NO的减少导致血管收缩，促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移[11]，肝细胞的有氧代谢增加，微循环受到抑制[12]，同时氧自由基增加，促进细胞膜脂质过氧化反应。机体存在清除自由基的途径，如体内的超氧化歧化酶（SOD）能够在正常情况下保持体内自由基的平衡，减少活性氧的产生，防止脂质过氧化对机体的损伤。

本研究通过高脂饲料喂养建立高脂血症（Hyperlipidomia,HLP）大鼠模型，除了评价罗布麻叶总黄酮（TFA）对高脂血症大鼠血脂代谢和肝组织病理形态的影响，还观察了TFA对肝脂代谢、血管内皮损伤程度（NO、Ang-II、VCAM-1）和体内氧化应激水平（MDA、SOD）的作用。结果表明，TFA能够明显改善高脂血症大鼠肝组织的脂肪变性，降低其肝脏、血清的TG、TC、LDL-C，并升高HDL-C；明显降低血清LDL-C/HDL-C和动脉硬化指数（AI），显著升高血清NO、SOD水平，降低Ang-II、VCAM-1和MDA水平。

综上所述，罗布麻叶总黄酮（TFA）能够明显改善由高脂饮食引起的高脂血症大鼠的脂质代谢，降低肝组织的有氧代谢，减少高血脂导致的血管内皮损伤，提高机体抑制自由基的脂质过氧化，以及增强自由基的清除能力。说明TFA对治疗高脂血症、保护血管内皮和预防AS具有良好的临床意义和应用前景。

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