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宁波市鄞州区食源性腹泻患者产气荚膜梭菌感染情况调查

2024-06-04 60 上传者：管理员

摘要：目的了解宁波市鄞州区食源性腹泻患者产气荚膜梭菌感染状况，为预防控制工作提供依据。方法采集宁波市鄞州区食源性腹泻监测点患者临床粪便标本，直接提取粪便基因组DNA,用荧光定量PCR检测产气荚膜梭菌cpa基因，阳性标本检测cpe、cpb2基因，以cpa阳性作为产气荚膜梭菌感染指标，分析不同特征食源性腹泻患者产气荚膜梭菌检出情况以及与其他食源性腹泻病原体混合感染状况。结果 534份标本中共检出产气荚膜梭菌cpa基因99份，检出率18.54%,cpa阳性标本的cpe、cpb2检出率分别为15.15%和78.79%;不同性别的食源性腹泻患者其产气荚膜梭菌检出率差异无统计学意义,但随年龄增大检出率呈下降趋势;产气荚膜梭菌引起的食源性腹泻全年好发，各月间检出率未见差异;不同可疑暴露食物及食物加工方式引起的食源性腹泻病人的产气荚膜梭菌检出率差异均无统计学意义；检出产气荚膜梭菌的标本中有24份混合感染诺如病毒、轮状病毒、沙门氏菌、副溶血性弧菌等其他食源性病原体。结论产气荚膜梭菌是宁波市鄞州区食源性腹泻的主要病原体之一，存在混合感染的情况，应重视对产气荚膜梭菌的病原学监测及预防。

关键词：
cpa基因
产气荚膜梭菌
人畜共患致病菌
荧光定量PCR
食源性腹泻
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产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)是一种重要的人畜共患致病菌，能分泌多种外毒素，引起人和动物食源性胃肠道疾病。根据其分泌6种主要毒素(α、β、ε、τ、cpe、NetB)可分为A～G 7个型别[1]。不同型别的产气荚膜梭菌对不同宿主产生不同的致病力，其中A型产气荚膜梭菌主要产α毒素，能引起人肠道感染[2],有报道产气荚膜梭菌居美国食源性疾病病原体前3位[3],在我国引起的食物中毒事件中也屡有报道[4,5,6]。产气荚膜梭菌是一种厌氧菌，常规培养不易生长，因此关注度较低，国内对产气荚膜梭菌引起食源性腹泻的流行病学相关研究较少。

为了解产气荚膜梭菌在该区引起的食源性腹泻状况，采集2020年8月—2021年7月宁波市鄞州区食源性腹泻监测点腹泻患者临床粪便标本，提取粪便基因组DNA,采用实时荧光定量PCR方法检测产气荚膜梭菌产α毒素的cpa毒素基因，并以此作为产气荚膜梭菌引起食源性腹泻感染的指标进行流行病学分析，同时探索合并感染其他腹泻的病原体情况，现将结果报告如下。

1、材料与方法

1.1 标本来源

采集2020年8月—2021年7月宁波市鄞州区食源性疾病监测点因食源性腹泻就诊的门诊患者粪便标本共计534份。

1.2 仪器与试剂

ViiA7荧光定量PCR仪 (美国ABI)。TIANamp Stool DNA Kit 粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司);TB Green® Premix Ex TaqTM[ 宝生物(大连)有限公司];SuperReal荧光定量预混试剂(天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 粪便核酸提取

取粪便0.2 g, 根据TIANamp Stool DNA Kit 粪便基因组DNA提取试剂盒试剂说明书提取细菌DNA,最终洗脱体积50 μl。

1.3.2 cpa毒素基因检测

根据文献[7]合成上游引物：5’-GATGGAAAAATTGATGGAAC-3’;下游引物：5’-CATGCATGTTCTCTTTTAAAAT-3’。配置总体积20 μl反应体系，包括TB Green® Premix Ex TaqTM 10 μl, 上游引物、下游引物和Rox Reference Dye Ⅱ 各0.4 μl, DNA模板2 μl, RNase-Free dd H2O 6.8 μl。按预变性95 ℃ 30 s, 变性95 ℃ 5 s, 退火/延伸60 ℃ 34 s, 40个循环，熔解95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 进行荧光定量PCR检测，根据PCR产物熔解温度在77.5 ℃之间来判断cpa毒素基因是否阳性。

1.3.3 cpe和cpb2毒素基因检测[8]

配置总体积20 μl反应体系，包括2×SuperReal PreMix(Probe)10 μl, 上游引物、下游引物各0.6 μl, 探针0.4 μl, RNase-Free dd H2O 6.4 μl, DNA模板2 μl。按预变性95 ℃ 15 min, 变性95 ℃ 1 s, 退火/延伸60 ℃ 30 s, 40个循环，单点荧光检测在60 ℃进行。引物和探针基因序列见表1。

表1 产气荚膜梭菌荧光定量PCR引物和探针序列(5’-3’)

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计数资料采用例数(%)表示，率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 基本情况

共收集食源性腹泻患者粪便标本534份，其中男性278份，女性256份，患者年龄为6～89岁。标本共检出cpa基因阳性99份，检出率为18.54%。

2.2 产气荚膜梭菌感染人群分布

不同性别人群中，男性检出率为21.22%(59/278),女性检出率为15.63%(40/256),差异无统计学意义(χ2=2.765,P>0.05)。不同年龄组人群中，0岁～组、10岁～组、20岁～组、30岁～组、40岁～组、50岁～组及>60岁组的检出率依次60.00%、24.56%、19.47%、18.64%、20.45%、15.69%和4.69%,检出率随年龄增加呈下降趋势见表2。

表2 产气荚膜梭菌感染人群分布

2.3 产气荚膜梭菌感染时间分布

2020年8月—2021年7月腹泻患者的产气荚膜梭菌检出率在10.53%～25.81%之间，各月间的检出率差异无统计学意义(χ2=6.926,P>0.05),见表3。

表3 产气荚膜梭菌感染时间分布特征

2.4 可疑暴露食品及食品加工方式

感染产气荚膜梭菌的可疑暴露食品前三位依次为粮食类及其制品、饮料与冷冻饮品、肉与肉制品，检出率分别为34.21%、23.53%和23.48%,不同食物来源病例产气荚膜梭菌检出率差异无统计学意义(χ2=6.856,P>0.05);不同食物加工方式在检出率差异无统计学意义(χ2=12.329,P>0.05),见表4。

表4 可疑暴露食品及食品加工方式产气荚膜梭菌感染状况

2.5 cpe和cpb2毒素基因检出情况

99份cpa基因阳性标本中检出cpe毒素基因15份，检出率为15.15%;检出cpb2毒素基因78份，检出率为78.79%。其中，同时检出cpe和cpb2毒素基因的13份，检出率为13.13%。

2.6 产气荚膜梭菌与其他病原体混合感染情况

99份cpa基因阳性标本中，其他致泻病原体检测阳性24份，混合感染率为24.24%;其中与病毒混合感染14份，分别为诺如病毒10份、A组轮状病毒和星状病毒各2份；与致病菌混合感染10份，分别为副溶血性弧菌4份、致病性大肠埃希氏菌4份、沙门氏菌2份。

3、讨论

产气荚膜梭菌为革兰氏阳性厌氧芽胞菌，传统培养法要求条件苛刻，一般检验科很少进行培养，为食源性致病菌的非常规检测项目。本研究从腹泻患者粪便中提取细菌DNA,用荧光定量PCR方法检测产气荚膜梭菌cpa、cpe和cpb2毒素基因，结合流行病资料，系统阐述了鄞州区食源性腹泻患者产气荚膜梭菌的感染状况，为该菌的感染防控提供了依据。

本次研究从534份食源性腹泻患者标本中共检出99份产气荚膜梭菌，检出率为18.54%,检出率与相关报道[9,10,11]相近，高于该地食源性腹泻监测常规病原体15.01%检出率[12]。表明产气荚膜梭菌是该地重要的食源性腹泻致病菌。cpb2编码的β2毒素与肠道疾病强相关性[13],cpe是导致产气荚膜梭菌细菌性食物中毒、呕吐及腹泻的重要原因，在胃肠道感染中发挥着重要作用[14],因此，毒素cpb2和cpe与食源性腹泻的发生密切相关。本次研究发现，检出产气荚膜梭菌中78.79%的标本cpb2阳性，有15.15%的cpe阳性，进一步查找患者资料，发现cpb2、cpe单毒素基因阳性与多毒素基因阳性之间的症状无明显差异，主要表现均为腹泻、恶心、呕吐等肠道感染症状。

相关研究报道[15],产气荚膜梭菌引起食物中毒有一定的季节性，以夏、秋季为多，肉类为主的高蛋白食品是产气荚膜梭菌引起食物中毒的主要载体[16]。本次调查发现，在宁波市鄞州区由产气荚膜梭菌引起的食源性腹泻常年好发，不具有季节性，且可疑食品种类和加工方式多样，提示引起腹泻的产气荚膜梭菌来源复杂。因产气荚膜梭菌的芽胞高温耐受性强，能够在10 ℃～50 ℃温度下增殖，同时缓慢或不适当的冷却可使该菌快速生长[17],一旦食物中该菌超过105CFU/g就有引起食源性腹泻的风险。值得注意的是调查发现鄞州区食源性腹泻患者产气荚膜梭菌检出率随年龄增大而下降，可能与该地居民不同年龄段人群的饮食和就餐方式相关。因此，根据年龄阶段的不同，分别针对性分析各个年龄段的饮食结构开展调查和抽样检测，可能有利于快速筛查产气荚膜梭菌感染源并及时采取预防措施。此外，应加强对幼儿园、中小学食堂及餐厅等公共就餐场所的卫生检查，并对加工后食品的储存方式进行监督，从而有效预防产气荚膜梭菌引起的食源性腹泻。

调查发现，产气荚膜梭菌与其他腹泻相关病原体有较高的混合感染率。由于产气荚梭菌引起的症状与其他食源性腹泻病原体相似，多为腹痛、恶心、腹泻，且症状轻微[18,19],具有自限性，易出现由产气荚膜梭菌感染引起的食物中毒未被发现或漏检的情况，使产气荚膜梭菌引起的食源性疾病真实流行率被低估[20],因此，建议进一步加强产气荚膜梭菌引起食源性腹泻的监测。

综上所述，产气荚膜梭菌是宁波市鄞州区的食源性腹泻的主要病原体之一，存在混合感染的情况，应重视对产气荚膜梭菌的病原学监测及预防。

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