骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，其主要发生在长骨干骺端，如股骨、胫骨和肱骨，容易侵袭局部组织并进一步发展为全身转移[1]。OS的治疗方法包括手术切除和化疗。研究显示，非转移性OS患者的5年生存率达70%[2]，但OS患者仍面临化疗耐药、局部复发、肺转移等诸多挑战。化疗耐药可分为原发性耐药和获得性耐药，阿霉素（doxo‐rubicin，DOX）为OS的常用化疗药物，约50%的OS患者因DOX获得性耐药而影响了治疗效果[3]。因此，了解OS细胞DOX化疗耐药的分子机制对开发新的治疗方法并最终改善OS患者的预后至关重要。目前已发现有多种RNA[如长链非编码RNA（longnoncoding RNA，LncRNA）、微 小RNA（microRNA，miRNA）等]参与调控OS的进展、转移和化学耐药性[4]。肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在哺乳动物中广泛表达并具有进化保守性，研究显示，LncRNA MALAT1是OS的 潜 在 治 疗 靶 点[5]。 有 报 道 发 现 ，LncRNAMALAT1可以调控乳腺癌的进展和DOX耐药性[6]，但其能否调节OS的耐药性尚不清楚。miR-154-5p可在多种癌症中发挥抑癌基因作用，相关研究显示，miR-154-5p在DOX耐药OS细胞中表达下调[7]。细胞周期素D1（cy‐clin D1，CCND1）位于人11q13染色体上，可参与包括OS在内的多种癌症细胞周期和肿瘤增殖的调控[8]。本研 究 团 队 前 期 利 用Starbase网 站 分 析 发 现，LncRNAMALAT1与miR-154-5p、miR-154-5p与CCND1之间存在潜在的结合位点。基于此，本研究拟探讨LncRNAMALAT1靶向miR-154-5p/CCND1轴与OS细胞DOX耐药性的关系及可能的作用机制，以期克服OS的化疗耐药性，进而提高其治疗效果。

1、材料

1.1　主要仪器

本研究所用主要仪器包括DMi1型倒置显微镜（德国Leica公司）、MSFLO型流式细胞仪（杭州谱育科技发展有限公司）、9003021型实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仪[凯杰企业管理（上海）有限公司]、Multi‐skan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、RCCS-4HD型细胞培养仪（美国Synthecon公司）。

1.2　主要药品与试剂

DOX（货号51410ES10，纯度≥98%）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；敲低LncRNA MALAT1（shMALAT1）及 其 阴 性 对 照（sh-NC）、抑 制miR-154-5p（anti-miR-154-5p）及其阴性对照（anti-NC）质粒均购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司；DMEM培养基（货号iCell-0003）购自镜像绮点（上海）细胞技术有限公司；总RNA提取试剂盒（TRIzol法）、含脱氧核糖核酸酶Ⅰ逆转录试剂盒（货号分别为EZB-TZ1-L、RT3C）均购自上海海方生物技术有限公司；RT-qPCR检测试剂盒（货 号QPG-023）购 自 上 海吉 玛 制 药 技 术 有 限 公 司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（货号HB-CCK-8）购自汉恒生物工程（上海）有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（货号70-APCC101）购自杭州联科生物技术股份有限公司；BCA蛋白定量检测试剂盒（货号KL1DBE095）购自上海康朗生物科技有限公司；特超敏ECL化学发光检测试剂盒（货号EUL002）购自广州博鹭腾生物科技有限公司；荧光素酶报告基因测试盒（货号SLLU-200）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、兔源增殖细胞核抗原（proliferatingcell nuclear antigen，PCNA）、兔源CCND1、辣根过氧化物 酶 标 记 的 山 羊 抗 兔IgG（货 号 分 别 为ab226408、ab201673、ab16663、ab9482）均购自英国Abcam公司；PCR引物由苏州艾比拓生物技术有限公司设计、合成。

1.3　细胞来源

OS亲 代 细 胞MG-63、耐DOX的OS细 胞MG-63/DOX（货号分别为AM7868、AM7872）均购自美国典型菌种保藏中心。

2、方法

2.1 MG-63和MG-63/DOX细胞对DOX的敏感性检测

分别将悬浮在200μL培养基（含细胞5×103个）中的MG-63和MG-63/DOX细胞接种于96孔板，分别加入0、0.01、0.05、0.1、1μmol/L的DOX处理（采用浓度梯度筛选确定浓度），作为实验组，选择未经任何处理的正常细胞作为对照组，没有细胞只有培养基等其他成分的作为空白组，在37℃、5%CO2条件下孵育24 h后，每孔加入体积为10μL的CCK-8试剂，于37℃下孵育2 h，使用酶标仪于450 nm波长处检测光密度（optical density，OD），每组设3个复孔，每次2个平行，计算细胞存活率和 半 数 抑 制 浓 度（IC50），细 胞 存 活 率（%）＝（实 验 组OD－空白组OD）（/对照组OD－空白组OD）×100%。

2.2 MG-63和MG-63/DOX细胞LncRNA MALAT1表达检测

采用RT-qPCR法检测。使用Trizol试剂提取MG63和MG-63/DOX细胞的总RNA，合成cDNA，LncRNAMALAT1以GAPDH为内参，配置20μL的反应体系：定量酶10μL，cDNA 1μL，正、反向引物各1μL，去离子水7μL；反应条件：98℃变性10 s，57℃退火30 s，68℃延伸45 s，共35个循环。根据2－ΔΔCt计算MG-63和MG-63/DOX细胞中LncRNA MALAT1的相对表达量。引物序列及产物长度见表1。

表1 qRT-PCR引物序列及产物长度

2.3 miR-154-5p/CCND1轴与LncRNA MALAT1靶向关系的验证

2.3.1　细胞分组与转染

将10%胎牛血清加入含0.1μmol DOX（根据“2.1”项下结果确定）的DMEM培养基，培养MG-63/DOX细胞，每2～3 d进行换液。取对数生长期的MG-63/DOX细胞分为Control组（正常培养）、sh-NC组、sh-MALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组、sh-MALAT1+anti-miR-154-5p组，分别转染相应质粒。

2.3.2 LncRNA MALAT1、miR-154-5p、CCND1 mRNA检测

采用“2.2”项下方法检测各组MG-63/DOX细胞中LncRNA MALAT1、miR-154-5p（内 参U6）、CCND1mRNA（内参GAPDH）的相对表达量，以验证转染效率。2.3.3 MG-63/DOX细胞增殖检测采用CCK-8法检测。根据“2.3.1”项下方法将MG63/DOX细胞进行分组，再按“2.1”项下操作检测各组细胞的增殖情况，并计算细胞存活率。

2.3.4 MG-63/DOX细胞迁移和侵袭检测

（1）采用划痕实验检测。根据“2.3.1”项下方法进行分组，接种500个MG-63/DOX细胞于6孔板至80%～90%融合时，用10μL移液器枪头取细胞悬浮液在培养皿中间划痕，于0、24 h在显微镜下观察细胞的形态变化，并计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）＝（初始划痕宽度－细胞迁移距离）/初始划痕宽度×100%。（2）采用Transwell实验检测。根据“2.3.1”项下方法将MG-63/DOX细胞进行分组。在侵袭实验上室预涂Matrigel基质胶，收集转染的MG-63/DOX细胞，将细胞重悬于200μL无血清培养基中，以2×104个/孔加入上室，下室加入500μL含20%胎牛血清的培养基，孵育36h后，固定上室膜并染色，在显微镜下随机选择5个视野，统计迁移或侵袭细胞数。

2.3.5 MG-63/DOX细胞凋亡检测

采用流式细胞仪检测。根据“2.3.1”项下方法将MG-63/DOX细胞进行分组。收集细胞，重悬调整密度为1.0×106个/mL，加入100μL含有AnnexinⅤ-FITC/PI的溶液中，室温孵育20 min后，加入500μL孵育缓冲液，检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率＝（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

2.3.6 MG-63/DOX细胞中PCNA、CCND1蛋白表达检测

采用Western blot法检测。根据“2.3.1”项下方法将MG-63/DOX细胞进行分组。采用改良的RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟裂解细胞，提取蛋白质，采用BCA法检测蛋白浓度，再用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到聚偏氟乙烯膜上与GAPDH（稀释度1∶1 000）、PCNA（稀释度1∶5 000）、CCND1（稀释度1∶500）特异性抗体共同孵育，再加入二抗（稀释度1∶1 000），室温孵育1 h。采用Image J软件分析，以目标蛋白与GAPDH条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

2.3.7 LncRNA MALAT1、miR-154-5p、CCND1相互作用检测

采用双荧光素酶报告基因实验检测。将LncRNAMALAT1-野生型（wild type，WT）和LncRNA MALAT1-突变型（mutated type，MUT）、CCND1-MUT和CCND1-WT片段分别克隆到pmirGLO载体中，再与miR-154-5p模 拟 物（mimic）和 其 阴 性 对 照（mimic-NC）共 转 染 到MG-63/DOX细胞中，48 h后检测荧光素酶活性，以分析LncRNA MALAT1与miR-154-5p、miR-154-5p与CCND1之间的相互作用。

2.4　统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。满足正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较使用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α＝0.05。

3、结果

3.1　不同浓度DOX中MG-63和MG-63/DOX细胞存活率比较

与0μmol/L DOX组比较，0.01、0.05、0.1、1μmol/LDOX组MG-63细胞和MG-63/DOX细胞（0.01μmol/LDOX组除外）存活率均显著降低（P＜0.05），详见表2。经计算，DOX对MG-63细胞的IC50为0.07μmol/L，对MG-63/DOX细胞的IC50为0.13μmol/L。

表2　不同浓度DOX中MG-63和MG-63/DOX细胞存活率比较

3.2 MG-63和MG-63/DOX细 胞LncRNA MALAT1mRNA表达检测结果

MG-63/DOX细胞中LncRNA MALAT1 mRNA相对表达量显著高于MG-63细胞（2.36±0.35 vs.1.00±0.32，P＜0.05）。

3.3　 敲 低LncRNA MALAT1对MG-63/DOX细 胞 中DOX耐药相关mRNA表达的影响

sh-MALAT1组MG-63/DOX细 胞 中LncRNAMALAT1、CCND1 mRNA相对表达量显著低于Control组、sh-NC组，miR-154-5p相对表达量显著高于Control组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p组MG-63/DOX细胞中CCND1 mRNA相对表达量显著高于sh-MALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组，miR-154-5p相对表达量显著低于sh-MALAT1组、sh-MALAT1+antiNC组（P＜0.05）。结果见表3。

表3　各组MG-63/DOX细胞DOX耐药相关mRNA及蛋白表达比较

图1 MG-63/DOX细胞迁移的划痕实验图

图2 MG-63/DOX细胞凋亡流式图

3.4　敲低LncRNA MALAT1对MG-63/DOX细胞增殖的影响

sh-MALAT1组MG-63/DOX细胞存活率显著低于Control组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR154-5p组MG-63/DOX细 胞 存 活 率 显 著 高 于shMALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组（P＜0.05）。结果见表4。

表4　各组MG-63/DOX细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡相关指标比较

3.5　敲低LncRNA MALAT1对MG-63/DOX细胞迁移的影响

划痕实验结果显示，sh-MALAT1组MG-63/DOX细胞划痕愈合率显著低于Control组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p组MG-63/DOX细胞划痕愈合率显著高于sh-MALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组（P＜0.05）。结果见表4、图1。Transwell实 验 结 果 显 示，sh-MALAT1组MG-63/DOX细胞迁移数和侵袭数均显著低于Control组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p组MG-63/DOX细胞迁移数和侵袭数均显著高于sh-MALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组（P＜0.05）。结果见表4。

3.6　敲低LncRNA MALAT1对MG-63/DOX细胞凋亡的影响

sh-MALAT1组MG-63/DOX细胞凋亡率显著高于Control组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR154-5p组MG-63/DOX细 胞 凋 亡 率 显 著 低 于shMALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组（P＜0.05）。结果见表4、图2。

3.7　 敲 低LncRNA MALAT1对MG-63/DOX细 胞 中PCNA、CCND1蛋白表达的影响

sh-MALAT1组MG-63/DOX细胞中PCNA、CCND1蛋白相对表达量均显著低于Control组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p组MG-63/DOX细胞中PCNA、CCND1蛋白相对表达量均显著高于sh MALAT1组、sh-MALAT1+anti-NC组（P＜0.05）。结果见表3、图3。

图3 MG-63/DOX细胞中PCNA、CCND1蛋白表达电泳图

3.8　荧光素酶活性检测结果

在转染MALAT1-WT和CCND1-WT的MG-63/DOX细胞中，与mimic-NC组比较，miR-154-5p mimic组的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）。结果见表5。

表5　两组荧光素酶活性比较

4、讨论

OS由产生类骨质或未成熟骨骼的间充质细胞组成，具有恶性程度高、侵袭性强、易复发、易早期远处转移的特点，约40%的OS患者在最初诊断时已经发生转移[9]。DOX是OS患者常用的化疗药物之一，DOX可以破坏DNA的合成和复制，通过多种方式诱导癌细胞死亡[10]。研究发现，长期使用DOX等化疗药物可导致耐药性的产生[11]。OS对DOX的耐药是一个多因素过程，其作用机制尚不清晰。本研究通过探讨OS细胞对DOX耐药的分子机制，以期改善OS患者的治疗效果和预后。

4.1　敲低LncRNA MALAT1通过抑制OS细胞对DOX的耐药性

LncRNA凭 借 其 一 级 序 列 和 空 间 结 构，可 以 与DNA、RNA和蛋白质相互作用，在各种生物过程和疾病中发挥调控作用[12]。LncRNA MALAT1在OS中发挥致癌基因作用，Yang等[13]研究显示，LncRNA MALAT1表达 上 调 与OS患 者 较 低 的 生 存 率 有 关 ，LncRNAMALAT1过表达可通过靶向miR-873-5p/Rho相关蛋白激酶信号轴，促进OS细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制OS细胞凋亡。Li等[14]研究显示，骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡可通过调控LncRNA MALAT1/miR-143/神经膜蛋白2/Wnt/β-连环蛋白轴在体外促进OS细胞的增殖、侵袭和迁移，在体内促进裸鼠肿瘤生长。Yue等[6]研究显示，抑制LncRNA MALAT1可上调miR-570-3p表达，从而抑制耐DOX乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提高乳腺癌细胞对DOX的敏感性。本研究发现，在DOX耐药OS细胞中敲低LncRNA MALAT1可以抑制DOX耐药OS细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，提示敲低LncRNA MALAT1可能通过抑制DOX耐药OS细胞的恶性生物学行为，抑制OS的进展，增强化疗敏感性，进而提高OS的治疗效果。

4.2　敲低LncRNA MALAT1通过上调miR-154-5p的表达抑制OS细胞的DOX耐药性

miRNA是一组内源性的非编码RNA，LncRNA与编码RNA共享miRNA反应元件，LncRNA可以海绵化miRNA并促进其靶标mRNA的翻译[15]。Tian等[16]研究显示，OS组织中的miR-154-5p表达下调，过表达miR154-5p可抑制E2F转录因子5的表达，进而抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。Zhou等[17]研究显示，过表达circ-ATAD1可抑制miR-154-5p的表达，从而促进OS细胞的侵袭和迁移。本

研究团队前期利用Starbase网站分析发现，LncRNA MALAT1与miR-154-5p之间存在靶向结合位点。本研究结果表明，LncRNA MALAT1可以靶向负调控miR-154-5p；敲低LncRNA MALAT1导致miR-154-5p表达上调，而抑制miR-154-5p则可以逆转敲低LncRNA MALAT1对DOX耐药OS细胞生物学的作用，提示敲低LncRNA MALAT1可能通过上调miR-154-5p表达抑制DOX耐药OS细胞的恶性生物学行为，提高OS细胞对DOX的敏感性。

4.3 miR-154-5p通过靶向负调控CCND1抑制OS细胞的DOX耐药性

CCND1是一种效应基因，在真核细胞中普遍存在，其主要功能是调节细胞从G1期向S期转变进而参与细胞周期进程，在多种癌症组织中呈高表达[18]。Xin等[19]研究显示，过表达CCND1和细胞分裂周期蛋白34（cell di‐vision cyclin 34，CDC34）能促进OS细胞增殖，调节细胞周期；体内外实验均显示，过表达的miR-671-5p可以靶向负调控CCND1和CDC34的表达，抑制OS细胞的增殖，导致细胞周期停滞，可作为OS治疗干预的新靶点。Yang等[20]研究显示，LncRNA FLVCR-AS1可通过下调miR381-3p、上 调CCND1的 表 达 来 促 进OS生 长。Li等[21]研究显示，在对DOX耐药的OS细胞中，CCND1的转录水平显著高于原始细胞，LncRNA人浆细胞瘤转化迁移基因1（plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1）在OS细胞中的过表达伴随着CCND1的上调，进而促进OS细胞对DOX产生耐药性，且LncRNA PVT1诱导的耐药性可以通过敲低CCND1来有效减弱。此外，既往研究表明，LncRNA MALAT1可以靶向负调控miR-154-5p，通过降低miR-154-5p表达，并上调水通道蛋白9的表达来促进慢性收缩性损伤大鼠神经性疼痛的进展[22]。

本研究结果显示，miR-154-5p与CCND1之间存 在 靶 向 结 合 位 点 ，miR-154-5p可 以 靶 向 负 调 控CCND1，敲低LncRNA MALAT1可使CCND1 mRNA和蛋白表达下调，而抑制miR-154-5p则可使CCND1表达上调，提示LncRNA MALAT1可能通过海绵化miR-154-5p促进CCND1高表达，促进OS细胞对DOX耐药，Ln‐cRNA MALAT1/miR-154-5p/CCND1轴可作为OS化疗耐药性的潜在治疗靶点。

综上所述，敲低LncRNA MALAT1可以抑制OS细胞的DOX耐药性，其机制可能是通过靶向miR-154-5p/CCND1轴实现的。然而，本研究局限于细胞实验，后续将增加动物实验进行深入研究。

参考文献:

[ 3]叶天宝,张振宇,王伯仁,等. 多柔比星对人骨肉瘤细胞P-糖蛋白表达的影响[J]. 锦州医科大学学报,2022,43(3):53-56.

[15]范金柱,从飞,张文韬,等. Circ_0001461靶向抑制miR30a-5p对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响[J]. 现代生物医学进展,2022,22(8):1413-1418.

基金资助:甘肃省自然科学基金资助项目(No.24JRRA1149);

文章来源:梁福东,狄淑芳,罗伟,等.LncRNA MALAT1对骨肉瘤细胞阿霉素耐药性的影响机制研究[J].中国药房,2025,36(06):698-703.