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多形性胶质母细胞瘤中骨形成蛋白家族基因的预后价值研究

2020-07-10 338 上传者：管理员

摘要：目的：分析骨形成蛋白家族基因（BMPs）在多形性胶质母细胞瘤（GBM）中的预后价值，并探究影响GBM预后的因素。方法：从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中下载GBM样本的mRNA数据，使用DAVID数据库和基因功能预测网站GeneMANIA预测BMPs的基因功能。通过Pearson相关系数分析BMPs基因之间的相关性。使用Kaplan-Meier生存分析评估GBM患者的总体生存。结果：BMPs在正常脑组织中均有表达。BMP1、BMP2和BMP7在肿瘤组织中的mRNA表达高于正常组织（P<0.05）。BMP1、BMP2、BMP4、BMP6和BMP7之间呈高度正相关关系（P<0.01）。生存分析结果显示，BMP1高表达或BMP2低表达，均与GBM患者的不良预后相关（P<0.05）。基因富集分析提示BMPs基因功能与SMAD蛋白信号转导、膜结合囊泡、BMP受体结合和TGF-β信号通路等有关。结论：GBM组织中BMP1高表达和BMP2低表达提示GBM患者预后不良，BMP1和BMP2可能是GBM预后的潜在生物标记物。

关键词：
多形性胶质母细胞瘤
生物标记物
癌症基因组图谱
预后
骨形成蛋白家族
骨肿瘤
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骨科医生Marshall Urist发现，因其可诱导间充质干细胞形成骨骼和软骨而得名[4]。随着研究的深入，人们发现骨形成蛋白家族基因（BMPs）广泛分布于人体的各个组织中，且在胚胎的形成和发育、组织与细胞的分化和增殖等方面都起着重要作用[5]。近年来，有一些研究表明BMPs在恶性肿瘤中均有表达量的改变[6,7,8]，提示BMPs可能具有调节肿瘤细胞生物学行为的作用。本文从Onco Lnc数据库和癌症基因组图谱（TCGA）数据库中提取数据，探讨BMPs在GBM中的预后价值。

1、资料与方法

1.1资料收集

从OncoLnc和TCGA数据库中下载有关GBM患者存活率和临床信息的数据。这些数据包括GBM患者的ID、种族、性别、诊断年龄、生存时间、生存状态以及BMPsmRNA表达。首先将5个BMPs的子成员（BMP1、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7）导入数据库，其他BMPs子成员（BMP3和BMP5）由于表达量低至测不出或其他测序技术相关问题未纳入分析。

1.2基因表达水平和相关性分析

使用GTEx门户网站和基因表达谱交互分析数据集绘制正常人多种不同组织中BMPsmRNA表达水平的箱式图，以及正常组织和肿瘤组织间BMPsmRNA表达水平的箱式图。使用SPSS23.0进行Pearson相关系数分析，以评估BMPs基因之间的共表达关系。

1.3BMP基因的功能和共表达分析

用DAVID数据库和GEPIA数据集分析BMPs的基因功能，包括基因本体论（GO）和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）的通路分析。GO分析可分为3个部分，包括生物学过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（molecularfunctions,MF）。根据公式“富集指数=目标基因集中属于该通路的基因数量÷背景基因集中该通路所有基因的数量”计算出富集指数并进行作图。

使用基因功能预测网站GeneMANIA对BMPs家族成员以及相关基因进行基因相互作用（GI）分析。通过用于检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具数据库和Cytoscape(v.3.6.1）软件来进行可视化蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。

1.4生存分析

根据每个BMPmRNA的表达的中位数，将患者分为表达量高组和表达量低组。基于总生存期（OS）以评估GBM的预后。使用Kaplan-Meier法绘制BMPs的生存曲线。

1.5统计学方法

采用SPSS23.0和R3.6.0软件针对TCGA数据进行统计学分析，采用Kaplan-Meier法绘制BMPs的生存曲线，并计算log-rankP值来评估分组因素的预后价值；Pearson相关性分析用于探讨各BMPs家族中基因mRNA的表达量之间的相关性，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1正常脑组织和癌组织中BMPmRNA表达水平

在本研究中，测量了5个BMPmRNA表达水平，包括BMP1、BMP2、BMP4、BMP6和BMP7。BMPs广泛分布于正常脑组织中，如图1所示。其中，BMP1、BMP4在小脑中的表达量较高，而在其他脑组织中表达量较低；BMP2、BMP6在正常脑组织中表达均较低；BMP7在正常脑组织中表达均较高。

由GEPIA生成的BMP基因表达的箱线图显示，正常组织和GBM组织之间BMPmRNA表达存在差异。BMP1、BMP2和BMP7在GBM组织中的mRNA表达高于正常组织（P<0.01），见图2A、图2B和图2E。而癌组织中的BMP4mRNA和BMP6mRNA表达与正常组织比较，差异无统计学意义（P>0.05），图2C、图2D。

2.2人体组织中BMPmRNA表达的相关性

Pearson相关系数分析结果表明，BMP1、BMP2、BMP4、BMP6和BMP7mRNA的表达相互之间均呈高度正相关关系（P<0.01），见表1。

2.3BMP基因的生物学功能分析

通过DAVID数据库对BMPs进行功能分析，包括BP、CC和MF，以及KEGG途径，以此鉴定BMP基因的生物学功能（表2和图3）。使用GeneMANIA进行BMP基因及相关基因的相互作用分析，结果表明BMPs基因在人体内有共同的蛋白结构域，BMP2、BMP4与CHRD存在较强的物理连接，此外，还使用STRING数据库和Cytoscape软件进行PPI分析，其置信度为0.4，表明BMPs蛋白之间存在广泛的相互作用，其中，BMP1占较大比重，BMP1、BMP2、BMP4、BMP6和BMP7之间的作用关系较强。如上述分析所示，BMP基因主要富集在正向调控通路受限的SMAD蛋白磷酸化过程（GO:0010862）、膜结合囊泡（GO:0031988）、BMP受体结合（GO:0070700）、转化生长因子β(TGF-β)信号通路（hsa04350）等。

2.4生存分析

Kaplan-Meier生存曲线表明，BMP1高表达和BMP2低表达与GBM患者的不良预后相关（P<0.05），见图4A、图4B。其余3个BMP基因（BMP4、BMP6和BMP7）则与GBM患者的OS无关（P>0.05），见图4。

图1BMPs基因在多种正常组织中的表达

图2正常组织和GBM组织中BMPs基因表达的GEPIA箱线图

表1Pearson相关系数分析结果

表2使用DAVID数据库对BMPs基因进行GO分析的结果

图3使用DAVID数据库对BMPs基因进行KEGG分析的结果

图4BMPs基因Kaplan-Meier曲线

3、讨论

BMPs由一组结构相似的蛋白质构成，现已在脊椎动物中鉴定出十几种BMPs，除了BMP1属于金属肽链内切酶家族外，其余的骨形成蛋白均归属于TGF-β家族。BMPs广泛分布于人体多种组织，其功能也具有多效性，在人类发育的早期阶段是唯一能够单独诱导新生骨形成的信号分子。同时，BMPs还可发出表皮诱导信号指导神经嵴细胞的发育并诱导形成肾上腺素能表型[9]。近期还有研究证实，BMPs的异常表达与乳腺癌、肾癌、肺癌等恶性肿瘤密切相关[6,7,8]。

本研究于TCGA数据集下载GBM患者的BMPmRNA表达和生存数据，运用GO、KEGG和GeneMANIA等生物信息学分析法分析BMP基因的功能。绘制Kaplan-Meier曲线以评估BMPs基因作为预后生物标志物的潜力。

研究结果表明，BMP基因功能与SMAD蛋白信号转导、BMP受体结合、TGF-β信号通路和调节干细胞多能性的信号通路有关。在蛋白质相互作用水平上，BMP1、BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因之间存在相互作用。Pearson相关系数分析结果表明BMPs之间呈高度正相关关系（P<0.01）。BMPs基因的生存分析结果表明，BMP1高表达和BMP2低表达与GBM患者预后不良有关（P<0.05）。此外，尽管GBM癌组织中BMP7mRNA的表达与正常组织中的表达有显著差异，但它对GBM患者的OS没有影响。

随着研究的发展，脑肿瘤干细胞（BTSCs）正逐渐成为治疗人脑肿瘤的重要新靶标，患者化疗和放疗失败可能是源于该特定BTSC对标准治疗的耐药性模式[10]。本研究通过生物信息学分析发现，BMPs富集于调节干细胞多能性的信号通路，提示BMPs在GBM中也可能参与造成了肿瘤细胞的耐药。与CD133阴性细胞相比，CD133阳性细胞对放疗引起的DNA损伤的修复作用增强[10]，这可能导致了肿瘤细胞对放疗的耐受。有研究表明，BMPs可以减少CD133阳性细胞的数量，有效地阻断肿瘤的生长。其机制为BMPs激活其同源受体（BMPRs），并触发SMAD信号级联反应，从而降低肿瘤的增殖能力[11]，这与本研究预测的生物学功能相一致，即BMPs富集于SMAD蛋白信号转导、BMPs受体结合的过程。本研究结果表明，在GBM组织中，BMP2低表达与患者不良预后相关（P<0.05），可能是由于BMP2表达降低后，参与抑制肿瘤细胞增殖能力的降低，使得肿瘤细胞对放疗耐受性增强有关。

此外，本研究还发现BMP1高表达也与GBM不良预后有关（P<0.05）。目前国内外尚无文献直接报道关于BMP1与恶性肿瘤的关系，但有研究表明，BMP1通过切割潜在的TGF-β结合蛋白来控制激活TGF-β1[12]。而TGF-β1表达升高与胃癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌等恶性肿瘤的侵袭和转移能力增强有关[13,14,15]。这与本研究结果相符合，据此，本研究推测BMP1可能在GBM的侵袭和转移过程中通过激活TGF-β1而起到类似的间接促进的作用。

当然，本研究也具有一定的局限性。由于OncoLnc数据库和TCGA数据库的不完整，本研究仅通过Kaplan-Meier分析的对数秩检验来评估BMPs基因表达与OS之间的关系，在接下来的研究中应进一步使用独立的外部验证数据集以及临床标本来验证这些BMPs基因在GBM患者中的预后意义。在未来的研究中，BMPs基因在GBM中发挥作用的分子机制仍需要通过进一步的实验和临床研究来证明。

苏晓桃,李昊宇,陈少华,秦超.骨形成蛋白家族基因在多形性胶质母细胞瘤中的预后价值分析[J].广西医科大学学报,2020,37(06):1089-1094.

基金:国家自然科学基金资助项目(No.81860222)