骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤,约占所有儿科恶性肿瘤的2.4%[1,2,3]。骨肉瘤患者常用的化疗药物包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤,但化疗药物耐药情况也越来越普遍。目前,对于临床治疗中骨肉瘤化学耐药性的分子机制知之甚少。多项研究报道了Ca2+离子通道调节癌细胞凋亡的关键作用[4]。钙库操纵的钙内流(store-operatedcalciumentry,SOCE)已被确认为Ca2+进入非兴奋性细胞的主要通道[5]。Stim1位于内质网(endoplasmicreticulum,ER)膜中,是钙库操纵的钙通道(storeoperatedcalciumchannel,SOCC)的主要成分,也是内质网Ca2+的传感器[6,7,8]。先前的研究表明Stim1在癌症发生中起着关键作用。在乳腺癌动物模型中,敲低Stim1基因或抑制SOCE可降低肿瘤的转移性[9]。此外,敲低Stim1抑制了肝癌细胞的迁移,并增加了前列腺癌细胞的化疗敏感性[10]。但是,Stim1在骨肉瘤中的可能作用尚未完全解释。

内质网是必需的细胞器,在细胞存活和凋亡过程中发挥重要作用。在多种刺激下,未折叠和未完全折叠的蛋白质会积聚在内质网中,导致内质网应激。内质网在Ca2+稳态和Ca2+信号传导中起着至关重要的作用[11]。先前的研究报告称,顺铂可诱导内质网应激,并激活ATF4、CHOP和GRP78等内质网应激的分子标记物[12]。考虑到Stim1在内质网应激和细胞凋亡中的重要作用,本研究推测Stim1可能参与癌细胞的顺铂耐药性。

因此,本研究旨在探讨Stim1在骨肉瘤细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系及其可能机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与试剂

人成骨细胞系hFOB1.19和人骨肉瘤细胞系U-2OS购自美国典型培养物保藏中心(ATCC);RPMI1640培养基购自美国Invitrogen公司;Stim1、ATF4、CHOP、GRP78和GAPDH一抗购自美国SantaCruzBiotechnology公司;辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐购自美国sigma公司;Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;SuperScriptIIRT试剂盒购自美国Invitrogen公司;SYBRGreen实时PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司;RIPA裂解液购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;BCA蛋白质测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司;ECL检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Fura2-AM购自美国Invitrogen公司;改良Krebs-Henseleit溶液购自北京雷根生物技术有限公司;Stim1-siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司;HiperfectTransfectionReagent购自美国Qiagen公司;LipofectaminePlus试剂购自美国Invitrogen公司;Opti-MEM培养基购自Invitrogen;CCK-8试剂购自日本DojindoLaboratories公司;AnnexinV-FITC/PI双重染色试剂购自江苏凯基生物技术股份有限公司;FAC-Scan流式细胞仪购自美国BDBiosciences公司。

1.1.2患者和标本收集

50例骨肉瘤组织及配对的癌旁组织标本取自我院手术切除的骨肉瘤患者,患者先前均未进行任何化放疗及药物治疗。所有组织标本均用石蜡包埋进行免疫组织化学染色,或保存在液氮中进行RT-PCR和Westernblot分析。

1.2方法

1.2.1细胞培养

将人成骨细胞系hFOB1.19和人骨肉瘤细胞系U-2OS在含有10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640中培养,培养条件为37℃、5%CO2。顺铂耐药的U-2OS(U-2OS/DDP)细胞通过以高浓度顺铂培养进行建立,接种后每周两次添加顺铂,每2个月通过MTT分析法分析细胞存活率。顺铂对U-2OS的IC50值为10μg/mL。与未处理的U-2OS细胞相比,U-2OS/DDP细胞对顺铂的耐药性增加了3倍。分别将U-2OS细胞和U-2OS/DDP细胞用5μg/mL的顺铂处理24h。

1.2.2免疫组织化学

免疫组织化学用于检测Stim1在组织标本中的表达。将石蜡包埋的组织标本切成5μm厚的切片,并进行脱蜡和再水化。抗原修复后,将切片与3%过氧化氢孵育10min以阻断内切酶过氧化物酶活性,然后与Stim1一抗(1∶500稀释)在4℃下孵育过夜。用PBS冲洗后,将切片与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h。然后应用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)进行显色。在奥林巴斯光学显微镜下观察切片。阳性细胞被染为棕色或深棕色,在200×放大倍数下随机选择5个视野计算阳性细胞百分比。将≥50%细胞阳性染色的样本定义为阳性。将<50%细胞阳性染色的样本定义为阴性。

1.2.3RNA提取和RT-PCR

根据试剂盒说明书,使用Trizol试剂提取总RNA。使用SuperScriptIIRT试剂盒对分离的RNA进行反转录。通过SYBRGreen实时PCR试剂盒在ABIPrism7300型荧光定量PCR仪上进行RT-PCR。设计引物序列(表1),GAPDH用作内部对照,根据2-△△Ct法计算Stim1mRNA的相对表达量。

表1引物序列信息

1.2.4蛋白质印迹分析

使用含有蛋白酶抑制剂混合物的冰RIPA裂解液对组织或细胞进行裂解。通过BCA蛋白质测定试剂盒确定蛋白质含量。通过8%的SDS-PAGE分离30μg蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜用5%脱脂牛奶封闭1h,然后与一抗在4℃下孵育过夜。一抗包括Stim1、ATF4、CHOP、GRP78和GAPDH,均以1∶1000稀释。洗涤后,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1h,然后通过ECL检测试剂盒进行显影。

1.2.5钙离子内流的检测

将2μmol/LFura2-AM装入2mL改良Krebs-Henseleit溶液中,并在37℃下孵育30min。用1μmol/Lthapsigargin(Tg)耗尽Ca2+库,然后添加2mmol/LCa2+。用带有340和380nm波长滤波器的奥林巴斯IX81倒置荧光显微镜检查钙离子内流情况,并用OlympusCell^R软件进行分析。随机选择10个视野评估平均荧光。

1.2.6siRNA转染

通过转染人Stim1-siRNA敲低骨肉瘤细胞中Stim1。靶向Stim1的siRNA序列是5'-GGCTCTGGATACAGTGCTC-3'。非特异性siRNA寡核苷酸(NC-siRNA)用作阴性对照。按照制造商的说明,用HiperfectTransfectionReagent转染siRNA。

1.2.7质粒转染

委托上海吉玛制药技术有限公司将人Stim1的全长cDNA克隆到pCDNA3-HA质粒载体中构建过表达Stim1的骨肉瘤细胞(Stim1-pCDNA3),将空载质粒作为对照(NC-pCDNA3)。根据制造商的说明,将LipofectaminePlus试剂加入Opti-MEM培养基(Invitrogen)中,并将Stim1质粒瞬时转染细胞24h。

1.2.8细胞活力测定

将细胞以5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中过夜。然后添加CCK-8并在37℃下孵育2h。用酶标仪在450nm下测量每个孔的吸光度。

1.2.9细胞凋亡测定

根据试剂盒说明书,通过AnnexinV-FITC/PI双重染色法测定U-2OS细胞或U-2OS/DDP细胞凋亡。用FAC-Scan流式细胞仪对凋亡细胞进行计数。

1.3统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析,数据结果表示为平均值±标准差,通过单因素方差分析(ANOVA)或t检验比较计量资料的组间差异;通过χ2检验比较计数资料的组间差异;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1Stim1表达与骨肉瘤临床参数的关系

结果显示,Stim1阳性细胞被染为棕色或深棕色,阴性细胞未染色。将≥50%细胞阳性染色的样本定义为阳性(图1)。在本研究中,癌旁组织标本中共有14份Stim1阳性和36份Stim1阴性,阳性率为28.00%;骨肉瘤组织中共有31份Stim1阳性和19份Stim1阴性,阳性率为62.00%。癌旁组织和骨肉瘤组织的Stim1阳性率有显著差异(χ2=11.677,P=0.001)。此外,Stim1的阳性表达与骨肉瘤患者的TNM分期和远处转移有关(P<0.05),Stim1阳性患者中,74.19%(23例)为TNMⅢ期,87.10%(27例)发生远处转移。而Stim1阴性患者中,26.31%(5例)为TNMⅢ期,26.31%(5例)发生远处转移。而Stim1的阳性表达与骨肉瘤患者的年龄、性别和肿瘤大小无关(P>0.05)(表2)。

Stim1在人成骨细胞系hFOB1.19和人骨肉瘤细胞系U-2OS中的表达模式与其在癌旁组织和骨肉瘤组织中的表达模式一致,与hFOB1.19细胞相比,U-2OS细胞中Stim1的mRNA和蛋白表达水平分别显著升高了2.79倍和3.14倍(P<0.05)(图2)。

图1免疫组化检测Stim1在骨肉瘤组织中的阳性和阴性表达

2.2Stim1表达与骨肉瘤细胞顺铂耐药性的关系

结果显示,顺铂耐药的骨肉瘤U-2OS/DDP细胞中的Stim1mRNA和蛋白表达水平显著高于对照U-2OS细胞(P<0.05)。顺铂处理24h(5μg/mL)后,U-2OS和U-2OS/DDP细胞中Stim1表达水平均显著降低,但顺铂处理后U-2OS/DDP细胞中Stim1表达水平仍高于U-2OS细胞(P<0.05)(图3)。

表2Stim1表达与骨肉瘤临床参数的关系

2.3顺铂对骨肉瘤细胞钙离子内流的影响

结果显示,U-2OS/DDP细胞的钙离子内流显著高于U-2OS细胞。此外,顺铂处理后,U-2OS和U-2OS/DDP细胞中钙离子内流均被抑制,但顺铂处理后U-2OS/DDP细胞的钙离子内流仍高于U-2OS细胞(P<0.05)(图4)。

2.4顺铂对骨肉瘤细胞内质网应激的影响

结果显示,U-2OS/DDP细胞的内质网应激分子标记物(ATF4、CHOP和GRP78)的mRNA和蛋白表达水平显著低于U-2OS细胞(P<0.05)。顺铂处理后,U-2OS和U-2OS/DDP细胞中ATF4、CHOP和GRP78的mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05),但顺铂处理后U-2OS/DDP细胞的ATF4、CHOP和GRP78的mRNA和蛋白表达水平低于U-2OS细胞(图5)。

2.5下调Stim1对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

结果显示,转染siRNA敲低了U-2OS/DDP细胞中Stim1mRNA的表达。下调Stim1表达明显减少了U-2OS/DDP细胞中的钙离子内流(P<0.05)。顺铂处理均抑制了U-2OS/DDP细胞的增殖并促进了细胞凋亡(P<0.05)。然而,下调Stim1进一步抑制了细胞的增殖并促进了细胞凋亡。同时,下调Stim1进一步提高了ATF4、CHOP和GRP78mRNA的表达(P<0.05)(图6)。

图2Stim1在人成骨细胞系hFOB1.19和人骨肉瘤细胞系U-2OS中的表达

图3顺铂处理24h(5μg/mL)对U-2OS和U-2OS/DDP细胞中Stim1表达的影响

图4顺铂处理24h(5μg/mL)对U-2OS和U-2OS/DDP细胞钙离子内流的影响

2.6上调Stim1表达对顺铂耐药的骨肉瘤细胞增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

本研究将顺铂耐药的U-2OS/DDP细胞用过表达Stim1的pCDNA3-HA质粒进行转染,结果显示U-2OS/DDP细胞中Stim1mRNA的表达显著上调(P<0.05)。与下调Stim1表达对骨肉瘤细胞行为的影响效果相反,上调Stim1表达显著促进了U-2OS/DDP细胞中的钙离子内流(P<0.05)。并且上调Stim1表达降低了顺铂对细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用。同时,上调Stim1表达抑制了ATF4、CHOP和GRP78mRNA的表达(图7)。

3、讨论

Stim1位于内质网膜中,是钙库操纵的钙通道(SOCE)的主要成分,也是内质网Ca2+的传感器[6,7,8]。Stim1在癌症发生中起着关键作用。本研究发现Stim1在大多数骨肉瘤患者中高表达,并且Stim1的阳性表达与骨肉瘤患者的TNM分期和远处转移有关。其他研究中报道,在乳腺癌动物模型中,敲低Stim1基因可降低肿瘤的转移性[9]。与非肿瘤组织相比,Stim1在肝癌组织中过表达,敲低Stim1抑制了肝癌细胞的迁移,并增加了前列腺癌细胞的化疗敏感性[10]。此外,Stim1的下调促进了非小细胞肺癌细胞中顺铂诱导的细胞凋亡[13]。基于上述研究结果,可知Stim1在大多数癌症中扮演癌基因的角色,并且可能参与调控癌细胞的生物学功能及化疗耐药性。本研究还显示顺铂耐药的骨肉瘤U-2OS/DDP细胞中的Stim1表达水平明显上调,说明Stim1不仅参与骨肉瘤的发病过程,而且与骨肉瘤细胞化疗耐药性有关,Stim1可作为骨肉瘤预后的检测指标。

图5顺铂处理24h(5μg/mL)对U-2OS和U-2OS/DDP细胞中内质网应激标志物ATF4、CHOP和GRP78表达的影响

细胞内Ca2+在调节多种细胞过程中起着至关重要的作用,包括神经兴奋、骨骼肌收缩、内皮细胞增殖和巨噬细胞活化[14]。此外,Ca2+离子通道通过调节癌细胞凋亡介导化疗耐药性,使用Ca2+通道抑制剂处理癌细胞可明显促进细胞凋亡。本研究发现,顺铂耐药的U-2OS/DDP细胞的钙离子内流显著高于非耐药细胞。说明骨肉瘤的顺铂耐药性可能与细胞内钙离子浓度有关。由于Stim1是SOCE的主要成分,而SOCE是Ca2+进入非兴奋性细胞的主要通道[4,5]。其他研究报道,抑制SOCE通过促进自噬和细胞凋亡而增加肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[4]。因此,本研究推测下调Stim1可能通过关闭SOCE通道进而抑制钙离子内流来诱导细胞凋亡,从而降低顺铂耐药性。

图6下调Stim1对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

另外,内质网应激对Ca2+稳态和Ca2+信号传导以及化疗敏感性具有重要的调节作用[11,15]。先前的研究报告称,顺铂可诱导内质网应激从而促进细胞凋亡[11,12]。本研究发现,顺铂耐药的骨肉瘤细胞中的ATF4、CHOP和GRP78的表达水平显著低于非耐药细胞,顺铂处理可促进上述内质网应激标志物的表达,但顺铂耐药的细胞中的ATF4、CHOP和GRP78的表达水平始终低于非耐药细胞。上述结果说明骨肉瘤的顺铂耐药机制涉及内质网应激的抑制。其他研究报道,内质网内的Ca2+耗竭是内质网应激诱导细胞凋亡发生的主要原因[16],由于Stim1是Ca2+感受器,因此,本研究推测下调Stim1可能通过引起Ca2+耗竭来诱导内质网应激从而促进骨肉瘤细胞凋亡。

为了验证前文中关于Stim1在骨肉瘤细胞顺铂耐药中的作用假设,本研究通过转染靶向Stim1的siRNA敲低了顺铂耐药的U-2OS/DDP细胞中Stim1的表达,并通过转染过表达Stim1的pCDNA3-HA质粒来上调Stim1的表达。研究发现,下调Stim1抑制了骨肉瘤细胞的钙离子内流和细胞增殖,并促进了细胞凋亡。此外,下调Stim1进一步提高了内质网应激分子标志物ATF4、CHOP和GRP78的表达。然而,上调Stim1表达则可发挥相反的作用。值得注意的是,GRP78的高表达可能会增加癌细胞的化疗耐药性,因为GRP78可促进未折叠蛋白的折叠[17]。但是,如果内质网应激持续存在,则GRP78的高表达可促进介导细胞凋亡的ATF4和CHOP的表达,从而促进细胞凋亡,并抵消GRP78的促生存作用[18]。上述结果说明下调Stim1通过抑制钙离子内流并促进内质网应激诱导的细胞凋亡来降低骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。而骨肉瘤细胞中Stim1的高表达通过相同的机制提高了顺铂的耐药性。

本研究的不足之处在于以下几个方面:首先,在部分骨肉瘤组织中,Stim1仍为低表达模式,因此Stim1在骨肉瘤诊断和预后判断中的作用仍需要进一步分析论证;其次,本研究未能说明Stim1调控钙离子内流及内质网应激的确切分子及信号传导途径;最后,本研究未能进行体内动物实验验证本研究的结果及推论。上述几项不足之处也是本课题组接下来的主要研究方向。总之,本研究表明Stim1在骨肉瘤患者中高表达并与不良预后有关。Stim1的高表达可增加骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。下调Stim1通过抑制钙离子内流并促进内质网应激诱导的细胞凋亡来降低骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。

图7上调Stim1表达对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

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基金:国家自然科学基金青年项目(编号:81702359);陕西省重点研发计划项目(编号:2017SF-259);深圳市科技计划项目(编号:JCYJ20180301170035531)