骨质疏松症是一种常见的年龄相关的全身骨骼疾病。骨质疏松症患者骨强度减低，骨折风险更大。治疗骨质疏松症的主要治疗方法是药物治疗，但西药治疗的不良反应，如胃肠道反应等[1]，会影响患者用药依从性，从而影响用药效果。

临床上目前有许多复杂的植入体可用于治疗骨缺损，理想的骨支架应具有良好的骨诱导和血管生成能力、生物相容性和成本低等特点。植入体经常与各种具有成骨潜力的药物、蛋白质、生长因子和生物分子结合，以促进骨形成，从而提高植入物的性能。骨形态发生蛋白、生长因子和细胞疗法可应用于骨细胞的增殖和分化，具有成骨潜力的天然化合物也可以加入到这些植入体中[2]。天然化合物的不良反应较小，比合成药物更适合长期使用，延长化合物的给药时间可提高整体生物利用度和临床疗效。因此，运用生物信息学技术，从中药复方或成方中筛选可能对骨质疏松症有治疗作用的化合物是必要的。

骨愈灵胶囊为陕西天地人和药业有限公司生产的中药成方制剂，其处方以三七、血竭、红花、醋乳香及大黄等16味中药材组成，具有活血化瘀、消肿止痛及强筋壮骨等功效，用于骨质疏松及骨折。骨愈灵胶囊已收入《国家中成药标准汇编骨伤科分册》，目前已上市，且临床效果较好，其治疗机制可能与其滋补肝肾并具有较强的活血化瘀、消肿止痛、壮骨抗炎、扩张毛细血管和改善微循环有关。有研究报道，骨愈灵胶囊可有效促进骨折愈合，使骨痂较早出现[3]，骨痂生长情况良好，再通部分髓腔，可明显增加骨密度，改善骨质疏松造成的骨质丢失状态抑制骨质疏松症进一步恶化[4]。

此外，骨愈灵胶囊能有效改善局部的微循环，使水肿尽快吸收，达到消肿、止痛和抗炎的作用，以致促进局部肿胀的消退。在骨折早期使用骨愈灵胶囊治疗可调节血黏度、抗血小板凝集、诱导微血管扩张，并可诱导毛细血管生长，促进血管内皮生长因子的表达[5]。改善局部微循环及影响骨重建过程在促进骨折愈合中具有重要意义[6]。有研究表明骨愈灵胶囊在37.5g/kg剂量下灌胃对小鼠无急性毒性反应；6.25,3.13,1.56g/kg连续灌胃6个月对SD大鼠未见明显的长期毒性反应[7]，其疗效与疗程、剂量及个人体质有关[8,9]。目前临床尚无明显不良反应的报道。尽管已有研究证实骨愈灵胶囊具有治疗骨质疏松的作用[10]，但是其中主要的作用活性成分及具体作用机制还未知，故实验使用分子对接的方法筛选骨愈灵胶囊中抗骨质疏松症的主要活性成分，探究其可能的作用机制。

近年来，随着计算机技术的发展，运用分子对接技术筛选中药活性成分的技术越来越成熟，分子对接技术成为了热门科研工具。分子对接是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程，实现了在短时间内针对靶蛋白高通量虚拟筛选和评价可能的配体。

实验利用生物信息学及分子对接的方法筛选骨愈灵胶囊中可能治疗骨质疏松症的中药活性成分，探讨其治疗骨质疏松症的分子机制，为其治疗骨质疏松症的作用机制提供依据。

1、资料和方法

1.1 数据库、软件及分析平台

实验数据采集和分析采用的数据库和软件见表1。

1.2 建立小分子对接数据库

从TCMSP数据库和中药综合数据库中筛选骨愈灵胶囊的植物药化学成分，筛选条件为生物利用度(oralbioavailability,OB)≥20%，类药性值(druglikeness,DL)≥0.18。在PubChem数据库中下载筛选所得化合物的3D结构，保存为SDF格式文件。PubChem数据库中没有3D结构的化合物下载2D结构，并用ChemBio3D软件将2D结构转变为3D结构，保存为SDF格式文件。将所得化合物3D结构的SDF文件导入DiscoveryStudio软件中。由于骨愈灵胶囊是通过口服发挥作用的，所以只有肠道吸收好的化合物才能起作用，实验使用药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(Absorption,Distribution,Metabolism,Excretion,Toxicity,ADMET)预测工具筛选出人体肠道吸收性模型99%置信区间内的化合物。

1.3 构建骨质疏松症靶蛋白库

通过阅读以往文献并查询靶点数据库(therapeutictargetdatabase,TTD)[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]，整理与骨质疏松症相关的蛋白靶点，见表2，在PDB网站上下载相应的蛋白3D结构，保存为PDB格式文件。

将所得蛋白靶点3D结构的PDB文件导入DiscoveryStudio2016软件中，在系统视图中删除水分子，加氢原子。将原配体从蛋白靶点文件中删除，单独保存为一个SDF文件。分子对接是在指定的结合位点处随机搜索最优结合构象的一个过程。

因此，结合位点的设置是分子对接中极其重要的一个参数。实验使用PDB网站记载的蛋白结合位点，在PDB记载的结合位点中对靶点蛋白与筛选的活性成分和原配体进行LibDock快速分子对接。在对接模块LibDock中，最大保存构象设为1，选出配体与受体之间结合程度最高的构象，其他参数为LibDock给定的默认值。

1.4 LibDock对接得分及对接作用力分析

以原配体与蛋白靶点的LibDock对接分数为阈值，筛选大于阈值的骨愈灵胶囊活性成分，并对筛选的结果进行整理分析。运用“ReceptorLigandInteractions”模块中的“Show2DDiagram”功能生成配体-蛋白相互作用二维平面图，以便于实验更直观的观察两者的相互作用及关键的氨基端和基团。

1.5 毒性预测

将筛选所得活性成分的SDF文件导入DiscoveryStudio软件中，运用“ToxicityPrediction(TOPKAT)”模块对骨愈灵胶囊筛选所得活性成分进行毒性预测，在毒理学模型中选择“AmesMutagenicity”“AerobicBiodegradability”和“RatOralLD50”，待作业完成后，分析结果文件。诱导突变性概率结果为0.00-0.03时为低诱突变可能性；结果为0.31-0.70时为中诱突变可能性；结果为0.71-1.00时为高诱突变可能性。生物降解性概率结果为0.00-0.03时为低生物降解可能性；结果为0.31-0.70时为中生物降解可能性；结果为0.71-1.00时为高生物降解可能性。小鼠口服半数致死量(LethalDose50%,LD50)为计算所得的各活性成分的半数致死量浓度。

1.6 主要观察指标

见表3。

2、结果

2.1 骨愈灵胶囊活性成分筛选结果

TCMSP数据库和中药综合数据库中，骨愈灵胶囊的16味中药共记载有一千多种活性成分。在数据库中以生物利用度≥20%，类药性值≥0.18为筛选条件，筛选得到骨愈灵胶囊的植物药化学成分共245种。从PubChem数据库中共下载得到130个活性化合物。使用DiscoveryStudio软件的ADMET预测工具预测活性化合物吸收性。以人体肠道吸收性模型99%置信区间为阈值，共筛选出63种化合物，见图1和表4。

2.2 骨质疏松症相关作用靶点的结合情况

对筛选所得的63种活性成分与17个靶蛋白的对接结果进行分析，发现骨愈灵胶囊中的部分活性成分与多个靶蛋白有结合，可能通过多靶点起作用，见图2。

部分多靶蛋白对接的骨愈灵胶囊活性成分的信息见表5，包括各活性成分与靶蛋白对接的数量、诱导突变性、生物降解性和小鼠口服的LD50浓度。可看出，木犀草素、泽兰黄醇、(17Z)-7beta-Hydroxypregna-4,17(20)-diene-3,16-dione的诱突变概率较高，甘油棕榈酸酯、L-α-甘油棕榈酸酯的生物降解性概率较高。

靶蛋白与部分活性成分结合情况，见图3。从图3中可以看出糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)与富含脯氨酸的非受体酪氨酸激酶2(proline-RichTyrosineKinase2,PYK2)可与表3中全部活性化合物结合，c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)、ERβ、孕激素受体(PR)、p38蛋白激酶β(P38β)、转化生长因子(TGF-β)-活化激酶1(TGF-beta-activatedkinase1,TAK1)、c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)可与表3中大部分活性化合物结合。

说明骨愈灵胶囊可能主要通过糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、富含脯氨酸的非受体酪氨酸激酶2(PYK2)、c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)、雌激素受体β(estrogenreceptor,ERβ)、孕激素受体(PR)、p38蛋白激酶β(p38β)、转化生长因子(TGF-β)-活化激酶1(TGF-beta-activatedkinase1,TAK1)、c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)这几个靶蛋白发挥药理作用。

2.3 靶蛋白与活性成分对接结果

实验将活性成分与靶蛋白进行对接，将大于原配体对接得分的结果进行排序，具有较高分的对接有：c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)、c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)、细胞外信号调节激酶β(ERβ)、富含脯氨酸的非受体酪氨酸激酶2(PYK2)与苏式-二羟基脱氢二松柏醇、孕激素受体(PR)、p38蛋白激酶β(P38β)与(23E)-20,25-二羟基达玛-23-烯-3-酮、组织蛋白酶K(CathepsinK)、细胞外信号调节激酶β(ERβ)、蛋白激酶B2(proteinkinaseB2,AKT2)与L-α-甘油棕榈酸酯、p38蛋白激酶δ(P38δ)与芝麻素、转化生长因子(TGF-β)-活化激酶1(TAK1)与(24S)-20,24-环氧-25-羟基达玛树脂-3-酮，得分结果见表6。

根据以上对接结果可知，丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关的靶蛋白可与大部分筛选所得活性成分结合，所以接下来实验主要研究丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关靶蛋白各自与其得分最高的活性成分的相互作用关系，结果见图3。

部分活性成分与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关靶蛋白的分子对接见图4。c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)的ALA151和LYS93等与小分子有强氢键作用。LEU206、MET146、VAL196与配体的芳香环形成稳定的疏水堆积作用。ILE70、ALA91、VAL78的阳离子与配体苯环的π电子之间存在p-π共轭作用。在结合空腔外围，VAL197、GLY71等疏水氨基酸残基在保持蛋白结合空腔的疏水性作用中起到了重要作用。

p38蛋白激酶δ(P38δ)的ASP168、GLY34与小分子之间有较弱的碳氢键。LEU76与配体间有稳定的π-σ疏水堆积作用。PHE169的阳离子与配体苯环的π电子之间存在p-π共轭效应，同时也与配体芳香环之间形成稳定的π-π疏水堆积作用，由此推测，PHE169可能在P38δ蛋白和芝麻素的相互作用中起关键作用。

c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)的LEU168与配体的苯环之间有稳定的π-σ疏水堆积作用。LEU110、ILE32、VAL40的阳离子与配体苯环的π电子之间存在p-π共轭作用。红色虚线表示配体羟基氢原子部分可进行小幅调整，以在这一位置产生有利的相互作用。

富含脯氨酸的非受体酪氨酸激酶2(PYK2)的LEU556、LEU431与配体的苯环之间形成稳定的π-σ疏水堆积作用。ALA455、LEU504与配体的芳香环也同样形成疏水作用。

以上关于骨愈灵胶囊活性成分和骨质疏松症相关靶蛋白的对接分数以及分子对接图的结果表明，苏式-二羟基脱氢二松柏醇、(23E)-20,25-二羟基达玛-23-烯-3-酮、芝麻素、(24S)-20,24-环氧-25-羟基达66玛树脂-3-酮等化合物可能有预防和治疗骨质疏松症的作用。

3、讨论

3.1 文章结果分析

研究表明，使用药物治疗骨质疏松症的不良反应会降低患者的用药依从性，进而影响治疗效果，如骨形成促进剂甲状旁腺激素的长期使用会刺激破骨细胞的活性增强，导致骨丢失的增加[23]；使用骨代谢调节药物维生素D的治疗期间，需定时检测患者的血尿钙[24]。骨愈灵胶囊是临床上常用的治疗骨质疏松症药物，且目前临床尚无明显不良反应报道，但其中主要的作用活性成分还未知。在进行生物活性筛选前，运用分子对接的方法进行预筛选可降低实际筛选化合物的数目[25]，实验即运用DiscoveryStudio2016软件中的分子对接的方法筛选骨愈灵胶囊中抗骨质疏松症的主要活性成分，得到骨愈灵胶囊小分子的ADMET数据和骨质疏松症相关蛋白的作用数据。根据LibDock模块进行打分，分析骨愈灵胶囊活性成分与骨质疏松症相关蛋白的作用情况。

文章通过分析分子对接的数据，发现苏式-二羟基脱氢二松柏醇、(23E)-20,25-二羟基达玛-23-烯-3-酮、L-α-甘油棕榈酸酯、芝麻素、(24S)-20,24-环氧-25-羟基达玛树脂-3-酮可以通过作用于多个骨质疏松症靶蛋白，且与靶蛋白的结合分数较高，可能是骨愈灵胶囊中发挥抗骨质疏松症的主要成分，主要通过多靶点、多信号通路对骨质疏松病程产生影响。

有研究表明，芝麻素可能通过调控骨保护素和核因子κB受体活化因子配体在成骨细胞中的表达间接调节破骨细胞的发育，对破骨细胞的分化和功能起抑制作用[26]。苏式-二羟基脱氢二松柏醇来源于骨碎补，现代药理学研究发现，骨碎补能促进骨对钙的吸收，提高血钙和血磷水平，有利于骨折的愈合[27]；骨碎补还能有效预防去势导致的骨质疏松[28]。

同时，丝裂原活化蛋白激酶信号通路中的JNK3,PR,P38β，JNK,TGF-β，TAK1,PYK2靶蛋白可与大部分骨愈灵胶囊活性化合物结合，说明骨愈灵胶囊活性成分可能通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路发挥药理作用。

丝裂原活性蛋白激酶家族是细胞内一种保守丝氨酸蛋白激酶，参与介导细胞的生长、分化及发育等多种过程，在细胞信号传导过程中起重要作用[29]。丝裂原活化蛋白激酶信号通路对破骨细胞的分化有重要作用，同时也能通过核因子κB信号通路影响骨质疏松症的发展[30,31,32]。一旦受到细胞因子或外源性诱导剂的刺激，核因子κB就会从细胞质移位到细胞核中，调节炎症递质的表达。因此，抑制丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB通路对炎症反应具有保护作用[33]。活性氧通过激活丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB信号通路促进破骨细胞的过度活化[34]。

ERK、JNK和P38是破骨细胞分化和激活的关键因素。P38是调控炎症、细胞分化凋亡等多种过程中必不可少的调节因子[35]，是骨髓间充质干细胞成骨分化的关键因子[36]。有研究表明，葛根素通过激活P38蛋白可以剂量依赖的方式下调核因子κB信号通路来促进体外成骨细胞分化；此外，也可通过降低活性氧水平以及活性氧诱导的丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB信号通路来抑制体内和体外破骨细胞的分化和活性，从而减少骨量丢失[37]。ERK是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，ERK可通过调节Runx2和Alp活性而调控成骨细胞的分化[38]。香紫苏醇可能通过抑制ERK1/2信号通路来抑制破骨细胞生成[39]；安石榴甙通过干扰ERK和JNK的磷酸化，抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活来维持骨量[40]。

因此，实验主要分析骨愈灵胶囊活性成分与丝裂原活化蛋白激酶通路靶蛋白的结合情况，以PDB网站记载的对接口袋为位点，通过LibDock快速对接法筛选出与丝裂原活化蛋白激酶相关靶蛋白分子得分最高的化合物：苏式-二羟基脱氢二松柏醇、(23E)-20,25-二羟基达玛-23-烯-3-酮、L-α-甘油棕榈酸酯、芝麻素、(24S)-20,24-环氧-25-羟基达玛树脂-3-酮，活性化合物与靶蛋白之间主要通过氢键及共轭作用结合。ADMET预测数据和对接分数表明这5种化合物有毒性低、肠道吸收良好等优点。

3.2 后续验证实验方案设计

现有的实验基础表明，通过网络药理学筛选得到的成分作为骨愈灵胶囊的主要药效成分可能仅有理论上的意义，这些成分可能不会真正发挥该中药在临床上的药用价值。计算机分子对接模拟是为了筛除与靶蛋白没有作用的单体，留下与靶蛋白有相互作用的活性单体，但是这种相互作用是激活还是抑制，以及这种相互作用的强度如何，都需要做后续的细胞实验和动物实验才能得知。实验设计了后续课题组的的分子、细胞和动物实验，见表7和图5。

3.3 文章局限性及展望

由于中药复方中的中药有不同配比，活性成分含量也不同，分子对接无法确定成分的差异。文章将方剂中的活性成分作为天然化合物的分子库，借此寻找对骨质疏松症有治疗作用的药物。现有数据表明，通过网络药理学筛选得到的成分作为骨愈灵胶囊的主要药效成分可能仅有理论上的意义。计算机分子对接模拟是为了筛除与靶蛋白没有作用的单体，留下与靶蛋白有相互作用的活性单体，但是这种相互作用是激活还是抑制，以及这种相互作用的强度如何，都需要进一步实验验证。总之，实验运用生物信息学与分子对接方法预测骨愈灵胶囊治疗骨质疏松症的潜在活性成分、及其与骨质疏松症相关靶蛋白的结合情况，探究骨愈灵胶囊治疗骨质疏松症的可能分子机制，为进一步展开相关实验研究提供活性物质基础及思路。

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